銀杏葉提取物對糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元NGF、NT-3表達(dá)的影響*

趙 競,金可可,吳 亮,陳國榮,李劍敏△

(1.溫州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,溫州 325035;2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科,溫州 325003)

糖尿病可導(dǎo)致糖尿病腦病(diabetic encephalopathy,DE)目前已成共識(shí)[1],其主要特征表現(xiàn)為認(rèn)知功能減退、學(xué)習(xí)記憶力減弱、智力降低、情緒障礙等精神功能紊亂。近幾年來,神經(jīng)營養(yǎng)因子對影響認(rèn)知的中樞膽堿能神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)支持作用、抑制細(xì)胞的凋亡、調(diào)節(jié)突觸可塑性等作用在糖尿病腦病中特別引起研究者關(guān)注,而且認(rèn)為神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏是糖尿病腦病的病理機(jī)制之一[2]。神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏導(dǎo)致神經(jīng)生存轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的異常,Bax表達(dá)增強(qiáng)、Bax/Bcl-2比值增大引發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)使神經(jīng)元凋亡[3]。

我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物(extract of Ginkgo biloba,EGB)可通過降低海馬Bax的表達(dá)、減小Bax/Bcl-2比值從而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,提高神經(jīng)細(xì)胞的密度,保護(hù)I型糖尿病大鼠的認(rèn)知功能的損傷[4]。但EGB對糖尿病大鼠海馬的抗凋亡作用是否與其影響糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)有關(guān),有待進(jìn)一步證實(shí)。本課題用STZ誘導(dǎo)I型糖尿病模型,進(jìn)一步研究EGB對海馬神經(jīng)神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)表達(dá)的影響,探討EGB對糖尿病腦病的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)及枸櫞酸鈉分析純購于美國sigma公司;銀杏葉提取物(EGB)購于北京雙鶴高科天然藥物有限公司,批號:100718;兔抗鼠NGF、NT-3多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購于北京中杉生物技術(shù)有限公司;NGF、NT-3、及β-actin引物合成并訂購于上海生工生物工程有限公司;BCA蛋白定量測定試劑盒購自美國Pierec公司,BeyoECL Plus(免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒)購自碧云天生物技術(shù)有限公司;Morris水迷宮由溫州醫(yī)學(xué)院藥理研究所提供。MUVB-20凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Ultralum公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和糖尿病模型的建立

SPF級標(biāo)準(zhǔn)健康雄性SD大鼠30只,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號:SYXK(浙2010-0150),體重180～220 g,鼠齡2個(gè)月,隨機(jī)分成正常對照組(10只)和糖尿病模型組(20只),糖尿病模型組大鼠禁食12 h后,按65 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素,正常對照組則給予等體積的生理鹽水腹腔注射。注射后72 h測血糖在13.8 mmol/L以上者為制造模型成功。成功模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM組)、銀杏葉組(EGB組)。EGB組按8 mg/(kg.d)劑量腹腔注射EGB,糖尿病組和正常對照組則給予等體積的生理鹽水腹腔注射。所有動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水,飼養(yǎng),每周測體重1次,每兩周測血葡萄糖1次,飼養(yǎng)12周后行股動(dòng)脈放血處死大鼠。冰浴上立即取出腦并分離兩側(cè)海馬組織,并將海馬組織分別固定于10%中性福爾馬林液及-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大鼠生長過程中的相關(guān)指標(biāo)的測定

觀察大鼠精神狀態(tài)、每周監(jiān)測各組大鼠的體重,并每兩周行斷尾采血法(采用Johnson穩(wěn)步倍加血糖儀)測定大鼠血糖以動(dòng)態(tài)監(jiān)測大鼠血糖水平的變化。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮圓形,直徑 1.5 m,平臺(tái)直徑12 cm,水深30 cm。平臺(tái)置于迷宮東北象限正中,水面高出平臺(tái)5 cm,水溫保持在22℃～25℃。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)第12周開始水迷宮訓(xùn)練,將大鼠移至暗室中適應(yīng)30 min后開始測定。訓(xùn)練或測試時(shí)大鼠頭朝池壁,分別從正東、正南、正西、正北四個(gè)象限入水,設(shè)定最長游動(dòng)時(shí)間為120 s。120 s未找到平臺(tái)者,將其引至平臺(tái),放置30 s引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。每只大鼠每天實(shí)驗(yàn)一次,共進(jìn)行5 d,前4天為訓(xùn)練時(shí)間,第5天為測試。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均有圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的搜索到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間或稱潛伏期和搜索平臺(tái)的策略(直線式,記分4分;曲線式,記分3分,隨機(jī)式,記分2分;圓圈式,記分1分)。

1.5 Western bot免疫印跡法檢測海馬組織中NGF和NT-3的蛋白表達(dá)

于-70℃冰箱取出海馬組織(每組各3只),Western bot免疫印跡法具體步驟同前期試驗(yàn)所述[4],所用一抗?jié)舛?NGF 1∶500、NT-3 1∶500、GADPH 1∶1 000、二抗?jié)舛?1∶5 000

1.6 RT-PCR法檢測大鼠海馬組織NGF和NT-3的mRNA的表達(dá)

于-70℃冰箱取出海馬組織,按Trizol試劑說明書方法提取海馬組織總RNA。取1 μ g進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。所用RT-PCR擴(kuò)增引物(β-actin為內(nèi)參對照)如表1。PCR變性、退火和延伸溫度分別為94℃,56℃和72℃,反應(yīng)時(shí)間分別為15 s,45 s和60 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。循環(huán)完畢再 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠電泳分析。電泳后在紫外燈下拍攝照片,然后用MUVB-20凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Ultralum公司)對每一標(biāo)本的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行灰度掃描,以β-actin密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn),數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示。

Tab.1 Sequence of primers and length of PCR products

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組比較用單因素方差分析,均數(shù)間的兩兩比較用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

Con組大鼠體型適中,精神狀況良好,動(dòng)作自如,反應(yīng)靈敏,毛發(fā)平伏有光澤;DM組大鼠消瘦,精神萎靡,反應(yīng)遲鈍,毛豎無光澤,動(dòng)作遲緩,弓背蜷體;EGB組相對DM組大鼠體型較胖,精神狀況與正常無差別,毛發(fā)較有光澤,活動(dòng)度較好。在為期12周的實(shí)驗(yàn)中,每周比較各組實(shí)驗(yàn)大鼠的體重,DM組大鼠的體重明顯低于Con組和EGB組(P＜0.05,圖1)。

Fig.1 Weight change of each group rat(±s,n=8～10)Con:Control group;DM:Diabetic group;EGB:EGB-treated group

2.2 EGB對I型糖尿病大鼠血糖水平的影響

在為期12周的試驗(yàn)中,Con組大鼠血糖穩(wěn)定在正常水平,DM組大鼠血糖升高并趨持續(xù)升高狀態(tài),而EGB組血糖明顯低于DM組,并相對穩(wěn)定,無持續(xù)升高的趨勢,DM組和EGB組比較,有顯著差異(P＜0.05,圖2)。

Fig.2 Effect of EGB on blood glucose of rats in each group(±s,n=8～10)

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力測試及評價(jià)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的第1～2天,各組間潛伏期比較無顯著差異(P＞0.05);第3天出現(xiàn)正常對照組潛伏期明顯較DM組和EGB組縮短(P＜0.05,P＜0.01),而DM組和EGB組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);第4天出現(xiàn)正常組、EGB組的潛伏期均明顯較DM組縮短(P＜0.01),但正常組與EGB組比較無顯著差異(P＞0.05);第5天出現(xiàn)正常組、EGB組的潛伏期均明顯較DM組縮短(P＜0.05,P＜0.01),但正常組與EGB組比較無顯著差異(P＞0.05,圖3)。比較第5天各組實(shí)驗(yàn)大鼠搜索平臺(tái)的策略:從高分到低分依次為正常對照組＞EGB組＞DM組,DM組分別與正常對照組和EGB組比較均有顯著性差異(P＜0.01),而正常對照組與EGB組比較無顯著性差異(P＞0.05,圖4)。

Fig.3 Effect of EGB on escape latency of Morris water maze test(±s,n=10)

Fig.4 Effect of EGB on the platform searching score of Morris water maze test(±s,n=10)

2.4 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

取各組海馬組織,10%福爾馬林液固定,常規(guī)HE染色,光鏡下可見Con組大鼠海馬神經(jīng)元排列緊密,未見明顯的神經(jīng)元核固縮或體積縮小;DM組、EGB組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的核固縮,細(xì)胞體積變小,部分區(qū)細(xì)胞稀少,海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,以CA1和CA2段為著,但EGB組大鼠的海馬區(qū)的病變相對減少(圖5,見彩圖頁Ⅰ)。

2.5 各組大鼠海馬組織NGF、NT-3蛋白Western blot的檢測結(jié)果

NGF和NT-3蛋白在Con組大鼠海馬組織中的表達(dá)分別為0.827±0.115;2.643±0.344;在EGB組大鼠海馬組織中的表達(dá)分別為0.987±0.006;2.48±0.12;而兩者在DM組大鼠海馬組織中的表達(dá)明顯減弱,分別為 0.563±0.119;1.563±0.471。DM組大鼠海馬組織NGF和NT-3蛋白的表達(dá)分別與Con組、EGB組比較,差異顯著(P＜0.05,圖6)。

Fig.6 Western blot analysis of NGF and NT-3 in hippocampus of rats(±s,n=3)

2.6 各組大鼠海馬組織中NGF、NT-3基因的mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果

NGF mRNA和NT-3 mRNA在Con組大鼠海馬組織中的表達(dá)分別為1.709±0.007;4.72±0.243;在EGB組大鼠海馬組織中的表達(dá)分別為1.749±0.054;4.35±0.042;而兩者在DM組大鼠海馬組織中的表達(dá)明顯減弱,分別為0.912±0.094;2.456±0.237。DM組大鼠海馬組織NGF mRNA和NT-3 mRNA的表達(dá)分別與Con組、EGB組比較,差異顯著(P＜0.05,圖 7)。

3 討論

我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)I型糖尿病大鼠認(rèn)知功能的障礙與海馬神經(jīng)元的丟失,神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。EGB可通過線粒體通路減少海馬神經(jīng)元的凋亡,提高海馬神經(jīng)元密度從而減少糖尿病對海馬神經(jīng)元的損傷,保護(hù)糖尿病腦病大鼠的認(rèn)知功能。事實(shí)上,神經(jīng)元存活和凋亡都是通過復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制完成的[5,6]。

Fig.7 RT-PCR analysis of NGF mRNA and NT-3 mRNA in hippocampus of rats(±s,n=3)

神經(jīng)營養(yǎng)因子家族(neurotrophic factors,NTFs)是一類小分子多肽物質(zhì),在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育過程中能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、生長、生存及功能表達(dá)。在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中具有維持神經(jīng)細(xì)胞生存的作用。經(jīng)典的NTFs包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)和神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5(NT4/5)等,它們具有同源性。研究發(fā)現(xiàn)NGF、NT-3對海馬等膽堿能神經(jīng)元的抑制凋亡作用是通過它們與其特異性的受體(p75和TrKs)的結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的[7,8]。NGF、NT-3均可以與其特異性的受體(p75和TrKA)的結(jié)合,主要通過PI-3K/AKT和ras-MAPK通路激活神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),維持神經(jīng)元的存活;反之,在凋亡等損傷刺激因子的作用下,神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏可使神經(jīng)元功能受損,促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加,Bax/Bcl-2的比值增大引發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[3]。

本實(shí)驗(yàn)通過STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病大鼠的模型,動(dòng)態(tài)觀察糖尿病大鼠的體重和血糖變化,發(fā)現(xiàn)12周內(nèi)糖尿病大鼠的血糖一直趨于上升的趨勢,同時(shí)體重明顯的減輕。12周末的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示糖尿病大鼠潛伏期延長,搜索平臺(tái)的策略明顯降低,提示此時(shí)糖尿病大鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能損傷。海馬組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)糖尿病腦病大鼠海馬結(jié)構(gòu)的異常,表現(xiàn)為海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的核固縮,細(xì)胞體積變小,部分區(qū)細(xì)胞稀少,海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂。說明12周的模型大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷的同時(shí)海馬形態(tài)學(xué)也表現(xiàn)異常。研究表明海馬與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān),海馬的損傷直接影響其功能。本實(shí)驗(yàn)Western blot免疫印跡和RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠海馬組織中NGF、NT-3蛋白含量及mRNA的表達(dá)都明顯低于正常對照組,提示糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元處于神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏或低營養(yǎng)狀態(tài)。糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏,神經(jīng)元生存能力的降低,導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的丟失(主要表現(xiàn)為凋亡)與認(rèn)知功能障礙有關(guān)。神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏可能是糖尿病腦病大鼠認(rèn)知功能障礙的重要原因[9]。最近有研究發(fā)現(xiàn),增加海馬區(qū)NGF水平能夠減少老化鼠的腦神經(jīng)元凋亡,從而降低腦組織老化和神經(jīng)元損害的風(fēng)險(xiǎn)[10]。本實(shí)驗(yàn)EGB干預(yù)治療后,糖尿病大鼠的體重增加、血糖明顯改善,海馬神經(jīng)元的病理學(xué)改變減輕。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示糖尿病大鼠潛伏期縮短,搜索平臺(tái)的策略明顯提高,提示EGB能改善糖尿病腦病大鼠的認(rèn)知功能,同時(shí)也說明減輕糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的損傷可改善糖尿病大鼠的認(rèn)知功能。Western blot免疫印跡和RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGB干預(yù)后糖尿病大鼠海馬的NGF、NT-3的表達(dá)明顯增加,可見EGB能有效提高糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的NGF、NT-3的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EGB改善糖尿病大鼠的認(rèn)知功能障礙與其提高糖尿病腦病大鼠海馬神經(jīng)元的NGF、NT-3的表達(dá)水平,緩解或部分緩解海馬神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)缺乏有關(guān)。

我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGB可降低糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的Bax、Caspase-3的表達(dá)以及Bax/Bcl-2的比值,減少神經(jīng)元的凋亡,提示EGB可通過線粒體凋亡途徑發(fā)揮其抗神經(jīng)元凋亡作用的。而Bax、Bcl-2和caspase-3等是PI-3K/AKT和ras-MAPK通路的下游分子,因此,我們推斷EGB增加糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、NT-3的表達(dá),NGF、NT-3與其受體結(jié)合后,可能通過PI-3K/AKT和ras-MAPK通路下調(diào)糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元Bax、Caspase-3的表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值,從而提高神經(jīng)元的抗凋亡的能力,發(fā)揮其對糖尿病大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用。但其內(nèi)在的機(jī)制尚未完全清楚,有待進(jìn)一步的深入研究。

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