急性低氧性缺氧小鼠血液粘度與紅細(xì)胞流變性變化*

張 敏,李新妙,馮 季,許幗杰,劉曉彬,姜 華,牛春雨,趙自剛

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所,張家口 075000)

充足的氧供是維持細(xì)胞能量代謝、保證細(xì)胞、組織、器官乃至機(jī)體生理功能的必要條件,而正常的血液流變性與紅細(xì)胞流變性是保證組織、器官血液灌注以及維持氧供的重要因素;凡引起血液流變性與紅細(xì)胞流變性的諸多因素(如:創(chuàng)傷、炎癥)均可導(dǎo)致組織、細(xì)胞的氧供不足,成為組織細(xì)胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-3]。研究表明,多種疾病引起的慢性低氧性缺氧(hypoxic hypoxia)均可導(dǎo)致血液流變性異常與紅細(xì)胞變形性下降[4-6],影響血管內(nèi)皮功能[7],進(jìn)而加重微循環(huán)障礙,引起組織缺血缺氧,形成惡性循環(huán)。但在臨床實踐中,由于自然災(zāi)害、意外事故等因素導(dǎo)致的急性低氧性缺氧(acute hypoxic hypoxia,AHH),對血液流變性與紅細(xì)胞流變性有何影響值得研究,這也是在臨床救治過程中需要關(guān)注的問題。為此,本文觀察了不同時間的急性低氧性缺氧對血液粘度與紅細(xì)胞變形性的影響,進(jìn)一步明確血液流變性變化在急性低氧性缺氧發(fā)展進(jìn)程中的作用,以血液流變性為研究靶點,為急性低氧性缺氧的臨床干預(yù)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康昆明小鼠32只(購自北醫(yī)三院動物中心),雌雄不拘,體重(29±2)g,按照數(shù)字隨機(jī)表法隨機(jī)分為對照組(n=8)、急性低氧性缺氧組(簡稱“低氧組”,n=24),由于小鼠在100 ml缺氧瓶中的死亡時間為13～15 min,因此為了觀察血液粘度與紅細(xì)胞流變性在小鼠急性低氧性缺氧發(fā)展進(jìn)程中的變化,將低氧組進(jìn)一步分為三個亞組(n=8):低氧5 min組、低氧8 min組、低氧11 min組,小鼠飼養(yǎng)環(huán)境:室溫20℃～23℃,相對濕度55%±15%,照明度 280～350 LX,光照節(jié)律12 h明12 h暗,晝夜交替,標(biāo)準(zhǔn)口糧(購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心),清潔飲水,自由飲食。實驗前所有小鼠禁食12 h,自由飲水。實驗過程中動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 動物模型復(fù)制與標(biāo)本留取

將3組實驗組小鼠依次置于低氧瓶中,在蓋緊瓶塞即刻記錄時間,分別低氧5 min、8 min、11 min,并密切觀察小鼠的活動情況、口唇及爪和尾部的發(fā)紺情況,復(fù)制急性低氧性缺氧模型。在低氧瓶中放入5 g的鈉石灰,以吸收小鼠在缺氧過程中呼吸出的二氧化碳,避免二氧化碳對呼吸中樞的刺激作用,以保證模型更符合臨床實際。在相應(yīng)時間點,將小鼠直接在缺氧環(huán)境下快速頸椎脫臼法處死,用1 ml注射器從小鼠心尖抽取血液0.8～1 ml于試管中;對照組小鼠置于低氧瓶中,但不給予低氧,5 min后直接頸椎脫臼法處死后從心尖抽取0.8～1 ml于試管中。將0.2%的肝素(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)溶液以0.3 ml/ml的比例緩緩加入留取的全血標(biāo)本中抗凝,輕輕混勻。

1.3 紅細(xì)胞比積測定

毛細(xì)管法:將抗凝血移入毛細(xì)管中,長度為40 mm左右,兩端用肥皂封口,在TGL-12B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器制造廠)以4 000 r/m的速度離心12 min,測毛細(xì)管中抗凝血柱全長和紅細(xì)胞沉積度,計算紅細(xì)胞壓積(hematocrit,Hct)。

1.4 全血粘度測定

應(yīng)用3-9D型微循環(huán)、血流變、紅細(xì)胞變形儀(成都麥賽科貿(mào)公司)通過綜合傳感法檢測各組小鼠的全血粘度,根據(jù)全血切變率的范圍:低切變率(1～20/s)、中切變率(50～60/s)、高切變率(范圍 100～300/s),結(jié)合血粘度的參數(shù)設(shè)置,本實驗選擇了1.0/s、10.3/s、30.7/s、40.3/s、115.0/s、300.0/s 等切變率下的全血粘度值作為觀察指標(biāo);然后將全血標(biāo)本置于KA-1000型離心機(jī)(上海飛鴿)中,以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,取血漿置流變儀中檢測血漿粘度。

1.5 紅細(xì)胞電泳

將上述離心后沉淀的血細(xì)胞與生理鹽水1∶1混勻,再次以2 500 r/m轉(zhuǎn)速離心10 min,棄上清液,留取底部洗滌后的血細(xì)胞沉淀物待測。將制備好的電泳液和電極液(配制方法見參考文獻(xiàn)[8])用吸管和加樣器加入電泳板的電泳槽和電極槽中,將制備的紅細(xì)胞加到電泳板上,用綜合分析儀中的電泳儀進(jìn)行群體細(xì)胞電泳,測量紅細(xì)胞移動的最大距離和最小距離,記錄數(shù)據(jù)測得紅細(xì)胞電泳率。根據(jù)全血粘度、血漿粘度、Hct結(jié)果,由四用分析儀的參數(shù)分析系統(tǒng)計算紅細(xì)胞聚集指數(shù)與紅細(xì)胞變形指數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血液流變學(xué)指標(biāo)的變化

低氧5 min組各切變率下的全血粘度、全血高切相對粘度、全血低切還原粘度均顯著低于對照組(P＜0.05),低氧11 min組各切變率下的全血粘度、全血低切還原粘度均顯著低于對照組(P＜0.05),低氧8 min組全血粘度各指標(biāo)與對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);低氧8 min組的全血高切相對粘度、全血低切還原粘度均顯著高于低氧5 min組(P＜0.05);各組間小鼠血漿粘度無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05,表 1)。

Tab.1 Changes of blood viscosity indices in mice(/s, ±s,n=8)

Tab.1 Changes of blood viscosity indices in mice(/s, ±s,n=8)

AHH:Acute hypoxic hypoxia*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs AHH for 5 min group

Whole blood viscosity(/s)Group 1.0 10.3 30.7 40.3 115.0 300.0 Relative viscosity(300)Reduced viscosity(1.0)Plasma viscosity(100.0)Control 7.199±1.524 5.170±1.093 3.706±0.783 3.400±0.719 2.442±0.516 2.132±0.451 2.060±0.433 0.173±0.030 1.044±0.180 AHH for 5 min6.195±0.757*4.449±0.544*3.189±0.390*2.925±0.358*2.101±0.257*1.835±0.224*1.665±0.203*0.131±0.013*1.105±0.092 AHH for 8 min6.845±1.076 4.916±0.772 3.523±0.554 3.232±0.508 2.405±0.468 2.027±0.318 2.022±0.364#0.160±0.040#1.033±0.254 AHH for 11 min5.991±0.544*4.303±0.390*3.084±0.280*2.829±0.257*2.032±0.184*1.775±0.161*1.860±0.281 0.145±0.020*0.964±0.087

2.2 紅細(xì)胞變形性參數(shù)的變化

低氧5 min組紅細(xì)胞變形指數(shù)高于對照組(P＜0.05),其它指標(biāo)與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);低氧8 min組和低氧11 min組的群體細(xì)胞電泳時間顯著長于對照組、細(xì)胞電泳長度與細(xì)胞遷移率顯著低于對照組(P＜0.05),低氧8 min組的紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著低于、紅細(xì)胞聚集指數(shù)高于低氧5min組(P＜0.05)。此外,低氧5 min組、低氧8 min組和低氧11 min組的Hct與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05,表2)。

Tab.2 Changes of erythrocyte rheology indices in mice(±s,n=8)

Tab.2 Changes of erythrocyte rheology indices in mice(±s,n=8)

AHH:Acute hypoxic hypoxia*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs AHH for 5min group

Group Electrophoresis time(s)Electrophoresis lengh(μ m.cm/s.v)Migration of erythrocyte(%)Erythrocytes aggregation index Erythrocyte deformability index Hematocrit Control 15.051±1.636 16.797±1.983 0.161±0.019 6.624±1.216 0.970±0.010 0.337±0.031 AHH for 5 min 15.587±1.282 16.146±1.476 0.155±0.014 5.621±0.686 0.982±0.004* 0.338±0.033 AHH for 8 min 16.538±0.991*15.165±0.906* 0.146±0.009* 6.826±1.229# 0.972±0.011# 0.358±0.033 AHH for 11 min 16.562±1.091*15.150±0.979* 0.145±0.009* 6.279±0.947 0.977±0.007 0.364±0.042

3 討論

缺氧是臨床上常見的、許多疾病共有的病理過程。以往研究表明,低氧性缺氧可以使動脈氧分壓、氧含量、血氧飽和度以及血紅蛋白攜氧能力降低,進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞流變性和血液粘度異常,這又成為疾病惡化的重要因素。因此,進(jìn)一步的研究血液粘度和紅細(xì)胞流變性的變化可以為臨床搶救提供可靠依據(jù)。

血液粘度是血液的主要流變學(xué)特性并賦予血流以固有的阻力,粘度愈高流動性愈小[5]。本研究結(jié)果顯示,低氧5 min全血粘度出現(xiàn)了下降,隨后8 min時又出現(xiàn)了升高的趨勢,而在11 min則再次下降,因全血粘度主要受紅細(xì)胞數(shù)量的影響,故據(jù)研究結(jié)果可推測,小鼠急性缺氧引起了機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng),交感神經(jīng)、腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮,導(dǎo)致血管收縮,組織液回流增加,引起了血液稀釋,導(dǎo)致血液粘度下降,早期的這種變化對于維持良好的血液循環(huán)是有利的。血漿粘度主要與血漿蛋白有關(guān),急性缺氧引起的應(yīng)激情況下,可能會引起纖維蛋白原等急性時相反應(yīng)蛋白的生成增多,但由于隨之帶來的血液稀釋,導(dǎo)致血漿蛋白濃度并未出現(xiàn)顯著變化,故血漿粘度并沒有出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)變化,因此,去除血漿粘度影響的全血高切相對粘度就出現(xiàn)了與全血粘度相一致的結(jié)果。同樣,由于紅細(xì)胞比積雖有下降趨勢、但沒有統(tǒng)計學(xué)差異,也就使得去除紅細(xì)胞比積影響的全血低切還原粘度變化與全血粘度相一致。應(yīng)當(dāng)看到,與對照組相比,低氧8min的全血粘度與低氧5 min、11 min的結(jié)果不一致,結(jié)合全血高切相對粘度與全血低切還原粘度的變化,全血粘度的這種變化與血漿蛋白、紅細(xì)胞數(shù)量對于全血粘度影響的相互作用有關(guān),其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

紅細(xì)胞流變性受多種因素的影響。紅細(xì)胞電泳能力及紅細(xì)胞變形性是紅細(xì)胞流變性的重要指標(biāo),紅細(xì)胞電泳反映紅細(xì)胞的流動性,紅細(xì)胞變形能力是紅細(xì)胞在外力作用下改變新的形狀的能力,二者對于保障血液的流動性、紅細(xì)胞壽命和微循環(huán)有效灌注起著重要作用[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),低氧5 min后,紅細(xì)胞變形指數(shù)增高,低氧8 min組和低氧11 min組的群體細(xì)胞電泳時間顯著長于對照組、細(xì)胞電泳長度與細(xì)胞遷移率顯著降低,低氧8 min組的紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著低于、紅細(xì)胞聚集指數(shù)高于低氧5 min組,結(jié)果表明,急性缺氧引起了小鼠的紅細(xì)胞流變性異常,這也是加重微循環(huán)障礙的關(guān)鍵因素。

綜上所述,急性低氧性缺氧引起了小鼠的血液流變性異常,表現(xiàn)在血液低粘、紅細(xì)胞電泳能力與變形性下降、紅細(xì)胞聚集性增加;盡管血液低粘并非加重微循環(huán)障礙的原因,但低粘可進(jìn)一步引起紅細(xì)胞攜氧能力下降[10],加重缺氧;研究結(jié)果也表明,紅細(xì)胞流變性異?？赡茉诩毙匀毖跻鸬奈⒀h(huán)障礙、組織細(xì)胞損傷的發(fā)病學(xué)中發(fā)揮更為主要的作用。

[1]尚金星,張 梅,趙自剛.缺氧致細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008,25(6):80-82.

[2]Pichon A,Connes P,Quidu P,et al.Acetazolamide and chronic hypoxia:effects on hemorheology and pulmonary hemodynamics[J].Eur Respir J,2012(Epub ahead of print).

[3]van PatotM C,GassmannM.Hypoxia:adapting to high altitude by mutating EPAS-1,the gene encoding HIF-2α[J].High Alt Med Biol,2011,12(2):157-167.

[4]Yelmen N,Ozdemir S,Guner I,et al.The effects of chronic long-term intermittent hypobaric hypoxia on blood rheology parameters[J].Gen Physiol Biophys,2011,30(4):389-395.

[5]Esteva S,Panisello P,Torrella J R,et al.Blood rheology adjustments in rats after a program of intermittent exposure to hypobaric hypoxia[J].High Alt Med Biol,2009,10(3):275-281.

[6]梁晚益,羅德成,高玨琪,等.缺氧時大鼠紅細(xì)胞變形性損傷的機(jī)制研究[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,1997,13(4):306-308.

[7]Boyer L,Chaar V,Pelle G,et al.Effects of polycythemia on systemic endothelial function in chronic hypoxic lung disease[J].J Appl Physiol,2011,110(5):1196-1203.

[8]李俊杰,王偉平,牛春雨,等.正常淋巴液對大鼠血液流變性異常的干預(yù)作用[J].中國微循環(huán),2006,10(3):250-253.

[9]趙自剛,張玉平,劉春艷,等.腸系膜淋巴管結(jié)扎對急性失血大鼠紅細(xì)胞流變性的影響[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2010,26(4):470-473.

[10]吳 憂,馮靜茹,張 賽,等.不同容量液體對失血性休克家兔早期復(fù)蘇效果的影響[J].中國血液流變學(xué)雜志,2009,19(3):338-341.