葫蘆素B對肝癌細胞內阿霉素濃度的影響

楊 姣，周雪瑩，歷 文，朱曉琳，牛哲峰，張玉璽，李士峰，張美俠*

原發(fā)性肝癌是嚴重危害人類健康的重大疾病，是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一［1］，其治療仍然主要依賴于全身化療和相關治療如介入栓塞化療等。肝癌對化療藥物的敏感性較差，不論是單藥還是多藥聯(lián)合化療，其有效率均為10% ～20%。阿霉素(Doxorubicin，Dox)是臨床治療肝癌的常用藥物，但其反應率僅為15% ～20%。影響其療效的主要原因是腫瘤細胞產生多藥耐藥(Multi-drug resistance，MDR)，使細胞內抗癌藥物積聚程度降低。

葫蘆素類(Cucurbitacins)成分是從植物中提取的一類高度氧化的四環(huán)三萜類化合物，主要成分為葫蘆素B、E、I等，具有抗腫瘤、抗炎、提高機體免疫力等多種生物活性［2-3］。Sadzuka 等［4-5］報道，葫蘆素E通過促進阿霉素的細胞內泵入和降低其外排而提高阿霉素在腫瘤細胞中的濃度。因此，筆者推測，葫蘆素B可能通過相同的機制提高肝癌細胞內阿霉素的濃度，進而提高阿霉素的抗腫瘤效果。本研究以人源性肝癌細胞HepG2和鼠源性肝癌細胞H22為對象，利用反相高效液相-熒光測定法測定腫瘤細胞內阿霉素濃度，用于HepG2和H22細胞內阿霉素濃度的動態(tài)研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 注射用鹽酸表阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，葫蘆素B、阿霉素(沈陽藥科大學提供)。甲醇色譜純(天津四友生物醫(yī)學技術有限公司)，醋酸分析純(天津四友生物醫(yī)學技術有限公司)。高效液相色譜儀(Waters Model 1525，美國)，包括在線真空脫氣機、高壓二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱，Agilent 1100色譜工作站;熒光檢測器(Waters 2475，美國);色譜柱(150 ～4.6 mm，C18，Sunfine，Waters，美國)。

1.2 色譜條件 色譜柱:Waters Sunfine C18柱，4.6 mm ×150 mm，5 μm;流動相:甲醇-0.01% 醋酸(40∶60，V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;熒光檢測激發(fā)波長:495 nm，發(fā)射波長:560 nm;進樣量:10 μL。

1.3 標準儲備液的制備 準確稱取鹽酸阿霉素適量，加水溶解，定容于容量瓶，配制成濃度為5 μg/mL的阿霉素標準儲備液，4℃保存。

1.4 HepG2細胞樣品的制備

1.4.1 HepG2流入細胞阿霉素樣品的預處理取對數(shù)生長期HepG2細胞，按每孔5×106個/mL接種于6孔板培養(yǎng)，過夜貼壁后，棄上清，每孔加1 mL不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。將細胞分為3組，第1組(Dox組)加阿霉素(5 μg/mL);第2組(Dox+CuB 1 μM 組)先加葫蘆素B 1 μM，30 min后加入阿霉素(5 μg/mL);第3組(Dox+CuB 10 μM 組)先加葫蘆素 B 10 μM，30 min 后加入阿霉素(5 μg/mL)。于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 0、30、60、120、180、240 min。棄上清，加0.25%胰酶消化，用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入表阿霉素(5 μg/mL)做內標，再加入1 mL含0.3 mol/L鹽酸的50%乙醇萃取，充分混勻后，渦旋2 min，超聲波震蕩10 min。將樣品放置37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育 18 h，最后 10 000 r/min離心 10 min，取10 μL上清液進樣測定。

1.4.2 HepG2細胞阿霉素泵出樣品的預處理取對數(shù)生長期HepG2細胞，接種于貼壁培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。貼壁后棄上清，加入阿霉素(5 μg/mL)，在37℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。棄上清，加PBS洗3遍，加0.25%胰酶消化，用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液混勻。分成3組，第1組不加任何藥品;第2組加入葫蘆素B 1 μM，第3組加入葫蘆素B 10 μM。將樣品放入37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng) 0、30、60、90、120 min。收集細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入表阿霉素(5 μg/mL)做內標，加入1 mL含0.3 mol/L鹽酸的50%乙醇萃取，充分混勻后，渦旋2 min，超聲波震蕩10 min。將樣品放置37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育18 h，最后10 000 r/min離心10 min，取10 μL上清液進樣測定。

1.5 H22細胞樣品的制備 取H22懸浮細胞(1×107個/mL)，加PBS洗3遍，加入不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。其余同HepG2細胞。

1.6 統(tǒng)計方法 SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 標準曲線的繪制 取阿霉素標準液適量，配制濃 度 分 別 為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg/mL的 HepG2 細胞液樣品，取 10 μL 進行HPLC分析，以待測物阿霉素濃度為橫坐標，待測物與內標物表阿霉素的峰面積比值為縱坐標，用加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程，即為標準曲線。結果表明，HepG2細胞液樣品中阿霉素在0.1～6.4 μg/mL范圍內呈良好線性關系，標準曲線:Y=1.649 2 X+0.221(R2=0.993 4)。同法顯示，H22細胞液樣品中，阿霉素在0.625～20 μg/mL范圍內呈良好線性關系，標準曲線:Y=0.13 X+0.067 4(R2=0.996)。

2.2 專屬性實驗 分別取空白HepG2細胞和H22細胞，不加任何藥物，其余按其樣品預處理項下流入細胞樣品預處理操作。將一定濃度的阿霉素標準溶液和內標溶液加入空白HepG2細胞和H22細胞中，依“1.4.1”項下和“H22細胞阿霉素流入樣品的預處理”項下方法操作。結果表明，空白HepG2細胞和H22細胞中的內源性物質不干擾阿霉素和內標的測定，表明專屬性良好。

2.3 精密度實驗 取阿霉素標準液適量，按“2.1”項操作，制備低、中、高(濃度為 0.25、1.00、4.00 μg/mL)3個濃度細胞液樣品，每個濃度5個樣本，按日內和日間精密度測定要求分別進行測定。計算日內及日間精密度，結果顯示，HepG2細胞液日內精密度RSD分別為2.952%、0.883%、0.982%(n=5)，日間精密度 RSD分別為1.256%、1.826%、3.589%(n=5)，表明精密度良好。H22細胞日內精密度RSD分別為2.418%、2.797%、2.459%(n=5)，日間精密度RSD分別為1.826%、3.589%、2.759%(n=5)，表明精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗 取阿霉素標準液適量，按“2.1”項下操作，制備濃度4.00 μg/mL的細胞液樣品，在 0、1、5、10、18、24、36、48 h 測定，結果HepG2細胞液RSD=3.13%(n=8)，表明在測定時間內溶液穩(wěn)定性良好。H22細胞RSD=3.45%(n=8)，表明在測定的時間內溶液穩(wěn)定性良好。

2.5 回收率實驗 取空白HepG2和H22細胞液適量，按其“1.4”項下方法，取阿霉素標準液適量，加入制得的上清液中，制備低、中、高(0.25、1.00、4.00 μg/mL)3個濃度的細胞液樣品，渦流混合，取10 μL進行HPLC分析，按照標準曲線計算提取回收率，HepG2細胞液平均回收率為107.4%，表明回收率良好(見表1);同法測得H22細胞液平均回收率為105.93%，表明回收率良好(見表2)。

表1 HPLC法測定HepG2細胞液回收率(n=5)

表2 HPLC法測定H22細胞液回收率(n=5)

2.6 葫蘆素B對阿霉素在肝癌細胞中濃度的影響 由于阿霉素能自發(fā)熒光，而葫蘆素B不能自發(fā)熒光，所以用熒光檢測器測得的圖譜為阿霉素和內標物質表阿霉素的色譜圖。以時間為橫坐標、阿霉素和表阿霉素的峰面積比值為縱坐標，做線性回歸圖，并分析葫蘆素B對肝癌細胞中阿霉素濃度的影響。

2.6.1 葫蘆素B對阿霉素在HepG2細胞內流入的影響 阿霉素與葫蘆素B聯(lián)合應用后在細胞內的濃度升高，呈時間、濃度依賴性。在240 min時間點，Dox+CuB 10 μM組與 Dox組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 葫蘆素B對阿霉素在HepG2細胞內流入的影響

2.6.2 葫蘆素B對阿霉素在HepG2細胞內泵出的影響 阿霉素與葫蘆素B聯(lián)合應用后，從細胞內泵出的藥量減少。Dox+CuB 1 μM組在120 min時間點、Dox+CuB 10 μM 組在90 min及120 min時間點與Dox組之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖2。

2.6.3 葫蘆素B對阿霉素在H22細胞內流入的影響 阿霉素與葫蘆素B聯(lián)合應用后在細胞內濃度增加，且呈時間和濃度依賴性。Dox+CuB 1 μM組、Dox+CuB 1 μM 組與 Dox 組在60、120、180 min和/或240 min時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)，見圖3。

圖2 葫蘆素B對阿霉素在HepG2細胞內泵出的影響

圖3 葫蘆素B對阿霉素在H22細胞內流入的影響

2.6.4 葫蘆素B對阿霉素在H22細胞內泵出的影響 阿霉素與葫蘆素B聯(lián)合應用后，從細胞內泵出的藥量減少。Dox+CuB 10 μM組與Dox組在90 min與120 min時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖4。

圖4 葫蘆素B對阿霉素在H22細胞內泵出的影響

3 討論

近年來，腫瘤增殖抑制作用逐步成為一個研究熱點。葫蘆素B可以抑制多種腫瘤細胞如乳腺癌、鼻咽癌、喉癌、口腔鱗癌、肺癌、宮頸癌、肝癌、結腸癌、惡性黑色素瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等的增殖［6-12］。腫瘤細胞MDR原因之一是腫瘤細胞過表達ABC轉運蛋白，如P-gp、多藥耐藥相關蛋白(MRP)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)和肺癌耐藥蛋白(LRP)等［13］。P-gp等能將細胞內的藥物“泵”出細胞外，這與天然來源和疏水性藥物(如阿霉素)耐藥有關。本研究結果表明，葫蘆素B與阿霉素聯(lián)合應用，明顯抑制人肝癌細胞系HepG2和鼠源性肝癌細胞系H22生長。葫蘆素B可以濃度、時間依賴性地促進阿霉素在肝癌細胞HepG2及H22中的內流，抑制阿霉素從細胞內外排。因此，提高阿霉素在肝癌細胞中的濃度，可增強其抗腫瘤活性。

抗癌藥物的作用機制錯綜復雜，葫蘆素B與阿霉素共同抑制肝癌的詳細機制(如:葫蘆素B是否抑制P-gp的過度表達)，還有待進一步深入研究。本文方法簡便、準確，檢測限低，線性范圍寬，可分析測定腫瘤細胞內阿霉素濃度，并可拓展用于研究化療藥物在腫瘤細胞內外動態(tài)變化規(guī)律，探索腫瘤細胞MDR機制，進而用于尋找發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞MDR逆轉藥物。

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