花園蔥蝸牛形態(tài)學(xué)與PCR檢測鑒定技術(shù)

肖 瓊， 楊海芳， 艾洪木， 周衛(wèi)川

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福州 350002；2.福建出入境檢驗檢疫局，國家軟體動物檢疫鑒定重點實驗室，福州 350001；3.中國濕地博物館，杭州 310013）

花園蔥蝸牛形態(tài)學(xué)與PCR檢測鑒定技術(shù)

肖 瓊1，2， 楊海芳3， 艾洪木1， 周衛(wèi)川2＊

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福州 350002；2.福建出入境檢驗檢疫局，國家軟體動物檢疫鑒定重點實驗室，福州 350001；3.中國濕地博物館，杭州 310013）

花園蔥蝸牛（CepaeahortensisMüller）是我國新增的進境植物檢疫性有害生物名錄中的成員，該螺與近似種在貝殼形態(tài)上難以鑒別。本文應(yīng)用貝殼、軟體解剖和PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，研究了花園蔥蝸牛的檢測鑒定技術(shù)，結(jié)果表明，PCR方法特異性強、靈敏度高、檢測結(jié)果穩(wěn)定，并與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，該方法為非軟體動物分類專業(yè)的檢疫人員檢測鑒定花園蔥蝸牛提供了快速簡便的技術(shù)方法。

花園蔥蝸牛； 植物檢疫； PCR； 鑒定

花園蔥蝸牛（CepaeahortensisMüller）隸屬于軟體動物門，腹足綱，柄眼目，大蝸牛科，蔥蝸牛屬，是我國新修訂的進境植物檢疫性有害生物名錄中的成員之一，原產(chǎn)于歐洲，現(xiàn)已經(jīng)入侵至北美［1－3］，該螺在我國尚未分布，加強檢疫是防治該螺最為經(jīng)濟有效的技術(shù)措施。近年來，我國口岸從歐美進境的原木和集裝箱以及箱內(nèi)貨物的木質(zhì)包裝材料中多次截獲該蝸牛，表明該螺入侵的風(fēng)險較大［4］。

花園蔥蝸牛與其近似種，尤其是森林蔥蝸牛（CepaeanemoralisLinnaeus）在貝殼形態(tài)上難以鑒別，歷史上學(xué)名應(yīng)用十分混亂，給我國的實際檢疫工作造成了被動，也是世界各國檢疫工作中共同面臨的技術(shù)難題。最近20多年來，分子系統(tǒng)學(xué)飛速發(fā)展，即通過基因序列的比對和分析可以厘清物種的分類學(xué)地位［5－7］，因此可以應(yīng)用貝殼、解剖和分子特征相結(jié)合的方法，對花園蔥蝸牛及其近似種的分類學(xué)進行更為深入而詳盡的研究，為花園蔥蝸牛的快速準確鑒定提供新的技術(shù)手段。目前，軟體動物分類專業(yè)的檢疫人員相當匱乏，而PCR技術(shù)在國境口岸檢疫部門已經(jīng)普及，如果能設(shè)計出特異性引物用PCR擴增方法進行初選或鑒定，這個難題就迎刃而解。本文將應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，研究花園蔥蝸牛的檢測鑒定技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

建立PCR檢測方法的供試材料為花園蔥蝸牛成螺，產(chǎn)地意大利。驗證PCR方法的材料為各口岸局送鑒的軟體動物，包括花園蔥蝸牛、近似種森林蔥蝸牛和其他蝸牛（表1）。

1.2 主要試劑

天根生化科技（北京）有限公司的血液／細胞／組織基因組DNA提取試劑盒；2×TaqPCR Master Mix（組成為0.1UTaqPolymerase／μL；500mol／L dNTP each；20mol／L Tris－HCl（pH 8.3）；100mol／L KCl；3 mol／L MgCl2；其他穩(wěn)定劑和增強劑）、DNA Marker I均購自天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的準備

取花園蔥蝸牛的軟體腹足部分約0.1g，加液氮研磨。

1.3.2 DNA模板的制備

利用TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒提取，按使用說明書操作提取DNA，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計與合成

將提取的花園蔥蝸牛DNA，用無脊椎動物線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidaseⅠ，COⅠ）這一基因特定區(qū)段的通用引物L(fēng)CO－1490 5′－GGTCAACAACA ATCATAAAGATATTGG－3′；HCO－2198 5′－TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA－3′［17］擴增并測序，獲得花園蔥蝸牛COⅠ基因特定片段序列，然后用Primer 5和Oligo Demo 6軟件，根據(jù)引物設(shè)計原則［18］設(shè)計花園蔥蝸牛的物種特異性引物 HY（01）、HY（02）。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.4 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系的總體積為20μL，其中2×TaqPCR Master Mix 10μL，引物各0.5μL，DNA模板2μL，然后加水至20μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5min，95℃50s，55℃30s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃10min。

1.3.5 特異性試驗

以花園蔥蝸牛為陽性對照，按試劑盒方法提取經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確認為森林蔥蝸牛、散大蝸牛、蓋罩大蝸牛、斯文豪大蝸牛和灰尖巴蝸牛的DNA，先用通用引物L(fēng)CO－1490和 HCO－2198進行PCR擴增以證實DNA提取成功，然后再用特異性引物 HY（01）、HY（02）進行PCR擴增，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，以檢測該引物的特異性。

1.3.6 靈敏度試驗

將花園蔥蝸牛DNA模板進行104倍系列稀釋：10－4倍，10－8倍，10－12倍，10－16倍，然后進行PCR擴增，以確定檢測方法的靈敏度。

1.3.7 PCR檢測鑒定方法的驗證和應(yīng)用

將各口岸局送鑒的軟體動物（表1）用TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒，按使用說明書操作提取DNA，用設(shè)計的特異性引物HY（01）、HY（02）進行PCR擴增、電泳、條帶鑒定，并與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果比對，來驗證該方法的準確性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 花園蔥蝸牛的分布

花園蔥蝸牛主要分布中歐、北歐、冰島和北美地區(qū)。分布的國家包括英國、德國、法國、荷蘭、盧森堡、比利時、波蘭、瑞典、挪威、芬蘭和美國。在英國、德國、法國等歐洲國家是常見種［8－13］。

圖1 花園蔥蝸牛成螺貝殼形態(tài)特征

2.2 花園蔥蝸牛貝殼和卵的形態(tài)特征

花園蔥蝸牛成螺貝殼的主要鑒定特征為：貝殼扁球形，緩慢膨脹，有5～5.5個螺層，臍孔完全被唇緣覆蓋?？诖桨咨侄蹋ㄅ紶栍泻稚?。貝殼色彩明亮，有光澤，其上有微弱而不規(guī)則的生長線和螺旋狀的色帶0～5條，故也稱白唇彩帶蝸牛。貝殼在顏色和色帶數(shù)量方面變異很大。口唇是褐色的個體，在形態(tài)上難以與森林蔥蝸牛相區(qū)別，一般來說，花園蔥蝸牛貝殼更細薄一些，螺層更圓一些。殼高10～15mm，殼寬14～20mm（偶有22mm）［2，9－16］。

幼螺貝殼較小，殼質(zhì)薄，易碎，形態(tài)特征與成螺貝殼基本一致。

卵圓形，白色，直徑2mm 左右［2］。

2.3 花園蔥蝸牛的解剖特征

陰莖長，陰莖本體與陰莖差不多等長，陰莖本體略帶紫色。鞭狀體細長。陰莖牽引肌薄而寬，中等長度。授精囊柄長，略粗。矢囊大，橢圓形，無副矢囊。黏液腺兩枝，分別在陰道兩側(cè)，每枝二分叉，分叉后每枝又分2～3枝，即一支黏液腺有4～6個分支；黏液腺管狀，粗實且長，光滑。陰道呈紫色（圖2）。花園蔥蝸牛與森林蔥蝸牛生殖系統(tǒng)的區(qū)別在于：花園蔥蝸牛的黏液腺每枝有大于等于4個分支，而森林蔥蝸牛的黏液腺最多3個分支［2，13］；花園蔥蝸牛戀矢的橫切面是帶二分叉的刀片狀十字交叉，森林蔥蝸牛戀矢的橫切面是簡單的刀片狀十字交叉（圖3）［12］。

2.4 花園蔥蝸牛COⅠ基因的PCR擴增及序列測定結(jié)果

花園蔥蝸牛COⅠ基因片段PCR產(chǎn)物大小為710bp，序列測定結(jié)果已登錄到NCBI上，登錄號為JQ235165。根據(jù)片段序列，用Primer 5和Oligo Demo 6軟件設(shè)計出引物若干對，經(jīng)過軟件分析及退火溫度試驗，最終選擇花園蔥蝸牛的特異性引物為：

該對引物PCR產(chǎn)物的大小為453bp。

2.5 引物特異性擴增結(jié)果

用引物 HY（01）、HY（02）經(jīng)PCR反應(yīng)擴增花園蔥蝸牛、森林蔥蝸牛、散大蝸牛、蓋罩大蝸牛、斯文豪大蝸牛、灰尖巴蝸牛，并設(shè)ddH2O為空白對照，只有花園蔥蝸牛擴增出特異性片段，其他5種蝸牛和ddH2O對照均無特異性條帶出現(xiàn)，試驗結(jié)果與預(yù)期一致（圖4），說明該引物具有良好的特異性。

圖4 花園蔥蝸牛引物特異性擴增結(jié)果

2.6 靈敏度試驗結(jié)果

用紫外分光光度計測定提取的花園蔥蝸牛DNA濃度為232ng／μL，將模板DNA按104倍系列稀釋后進行PCR擴增，以ddH2O作為對照。結(jié)果顯示，在稀釋10－16倍后仍有微弱條帶，（圖5），說明此方法具有很高的靈敏度。

圖5 花園蔥蝸牛PCR靈敏度試驗結(jié)果

2.7 PCR檢測鑒定方法的驗證與應(yīng)用

對各口岸局送鑒的軟體動物進行形態(tài)學(xué)鑒定和PCR檢測方法比對。結(jié)果表明，形態(tài)學(xué)鑒定為花園蔥蝸牛的全部出現(xiàn)明亮的條帶，而形態(tài)學(xué)鑒定為其他種類的蝸牛均無出現(xiàn)條帶，PCR檢測結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定相符合，表明此引物具有良好的特異性和穩(wěn)定性，所建立的PCR檢測方法可應(yīng)用于花園蔥蝸牛的實際檢測鑒定工作（表1）。

表1 PCR檢測方法與形態(tài)學(xué)鑒定的比對結(jié)果和實際應(yīng)用

3 結(jié)論和討論

目前，對花園蔥蝸牛的鑒定主要是依據(jù)貝殼特征，而它的貝殼與同屬的森林蔥蝸牛極為相似，尤其是口唇為褐色的花園蔥蝸牛個體，確實與森林蔥蝸牛很難鑒別，即使是訓(xùn)練有素的陸生軟體動物分類專家，也必須通過解剖軟體的生殖系統(tǒng)才能鑒別。然而，迄今為止國內(nèi)農(nóng)業(yè)院校植物保護系既沒有開設(shè)軟體動物分類學(xué)專業(yè)課程，也沒有專門的師資和研究力量，而目前口岸檢疫工作主要是由植物保護專業(yè)的科技人員承擔軟體動物的檢疫鑒定，造成了實際檢疫鑒定工作的被動。近年來，PCR檢測鑒定技術(shù)在國境口岸部門已相當普及，本文所建立的PCR方法為檢測鑒定花園蔥蝸牛提供了新的技術(shù)和方法，也為非軟體動物分類專業(yè)的檢疫人員提供了快速簡便的檢測方法。

本研究所設(shè)計的特異性引物HY（01）、HY（02）對花園蔥蝸牛DNA進行PCR擴增，能擴增出與預(yù)期大小相符的條帶，并且與森林蔥蝸牛、散大蝸牛、蓋罩大蝸牛、斯文豪大蝸牛和灰尖巴蝸牛進行對照，均無條帶出現(xiàn)，建立了花園蔥蝸牛的PCR檢測鑒定方法，并在實際檢疫工作中得到驗證和應(yīng)用。試驗和應(yīng)用表明，該方法特異、敏感、穩(wěn)定。在實際檢疫過程中，分類專家可根據(jù)貝殼形態(tài)進行初步鑒定，然后用PCR方法進行驗證確認；對于非軟體動物分類專業(yè)的科技人員，則可先用PCR方法進行初篩，確認為花園蔥蝸牛的疑似種，再送分類專家進行最后確認，可確保鑒定結(jié)果準確可靠。

［1］Kerney M P，Cameron R A D.A field guide to the landsnails of Britain and North－west Europe ［M ］. London：Collins，1979：204.

［2］Species summary forCepaeahortensisAnimal Base［EB／OL］http：∥www.animalbase.uni－goettingen.de／zooweb／servlet／AnimalBase／home／species？id＝1371.Last modified，06－02－2011by F.Welter Schultes.

［3］Müller O F.Vermivmterrestriumetfluviatilium，seuanimaliuminfusoriorum，helminthicorum，ettestaceorum，non marinorum，succinctahistoria［M］.Volumen alterum.pp.I－XXVI［＝1－36］，1－214，［1－10］.Havniae ＆ Lipsiae.（Heineck ＆Faber），1774.

［4］周衛(wèi)川，陳德牛，林晶.花園蔥蝸牛的鑒定及與森林蔥蝸牛的鑒別［J］.植物檢疫，2007，21（2）：97－98.

［5］Wu S P，Hwang C C，Lin Y S.Systematic revision of the arboreal snailSatsumaalbidaspecies complex （Mollusca：Camaenidae）with descriptions of fourteen new species from Taiwan［J］.Zoological Journal of the Linnean Society，2008，154：437－493.

［6］Hillis D M.Inferring complex phylogenies［J］.Nature，1996，383：130－131.

［7］Hillis D M，Huelsenbeck J P，Cunningham C W .Application and accuracy of molecular phylogenies［J］.Science，1994，264（5159）：671－677.

［8］Germain L.Mollusques terrestres et fluviatiles（première partie）［M］∥ Faune de France 21：1－477，I－VⅢ［＝1－8］，Pl.I－XⅢ［＝1－13］.Paris.1930：194.

［9］Moquin－Tandon A.Histoire naturelle des mollusques terrestres et fluviatiles de la France contenant desétudes générales sur leur anatomie et leur physiologie，et la description particulière des genres，des espèces et des variétés［M］.Tome second.1855，pp.1－646，atlas 1－92，Pl.I－LIV［＝1－54］.Paris.（Baillière）：167.

［10］Williamson P.Age determination of juvenile and adultCepaea［J］.Journal of Molluscan Studies，1979，45（1）：52－60.

［11］Kerney M P，Cameron R A D，Jungbluth J H.Die landschnecken nordund mitteleuropas［M］.Ein Bestimmungsbuch für Biologen und Naturfreunde.pp.1－384，Taf.1－24.Hamburg，Berlin.（Parey），1983：282.

［12］Love dart［EB／OL］.http：∥en.wikipedia.org／wiki／Love＿dart.This page was last modified on 7October 2011at 20：11.

［13］A A Schileyko.Treatise on recent terrestrial Pulmonate mollusks.Part 13［M］.Ruthenica，Supplement 2.Moscow May，2006：1816－1817.

［14］Prieto C E，Altonaga K.Lasáreas de distribución de los helicoideos（Gastropoda，Pulmonata）del País Vascoy regiones adyacentes［J］.I.Sphincterochilidae，Elonidae，Helicodontidaey Helicidae.Iberus，1988，8（2）：1－8.

［15］Kerney M.Atlas of the land and freshwater molluscs of Britain and Ireland［M］.Colchester.（Harley），1999：204.

［16］Turner H，Kuiper J G J，Thew N，et al.Fauna Helvetica 2.Atlas der Mollusken der Schweiz und Liechtensteins［M］.Neuchatel，1998：373.

［17］Cowie R，Jones J.Ecological interactions betweenCepaeanemoralisandCepaeahortensis：Competition，invasion but no niche displacement［J］.Functional Ecology，1987，1（2）：91－97.

［17］Folmer O，Black M，Hoeh W，et a1.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates［J］.Molecular Marine Biology Biotechnology，1994，3：294－299.

［18］吳祖建，高芳鑾，沈建國.生物信息學(xué)分析實踐［M］.北京：科學(xué)出版社，2010：30－61.

Morphology and PCR identification technology ofCepaeahortensis

Xiao Qiong1，2， Yang Haifang3， Ai Hongmu1， Zhou Weichuan2
（1.CollegeofPlantProtection，F(xiàn)ujianAgriculturalandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，China；2.StateKeyLaboratoryofMolluscanQuarantineandIdentification，F(xiàn)ujian Entry－ExitInspection＆QuarantineBureau，F(xiàn)uzhou350001，China；3.NationalWetlandMuseumofChina，Hangzhou310013，China）

CepaeahortensisMüller is one of the species in the import plant quarantine pest list.This species is difficult to be distinguished from similar species by the shell characters.In this study，the shell characters，anatomical method and PCR were used to identifyC.hortensis.The results showed that PCR method had high specificity，sensitivity and stability，and it could provide a quick and easy technical method for identification ofC.hortensis.

Cepaeahortensis； plant quarantine； PCR； identification

S 41

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.022

2011－11－11

2011－12－07

福建省國際重點項目（201210001）；福建省自然科學(xué)基金項目（2012J01063）；國家自然科學(xué)基金項目（31040072）

＊ 通信作者E－mail：wczhou＠163.com