黃瓜褐斑?。–orynesporacassiicola）在廣東首次報道

藍國兵， 譚耀華， 何自福＊， 羅方芳， 梁麗歡， 虞 皓

（1.廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所，廣州 510640；2.廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640；3.高要市農業(yè)技術推廣中心，廣東 526100）

黃瓜褐斑病（Corynesporacassiicola）在廣東首次報道

藍國兵1，2， 譚耀華3， 何自福1，2＊， 羅方芳1， 梁麗歡3， 虞 皓1

（1.廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所，廣州 510640；2.廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640；3.高要市農業(yè)技術推廣中心，廣東 526100）

2011年5月和8月，在廣東省高要市和增城市黃瓜主產區(qū)發(fā)現黃瓜褐斑病，致病性測定、形態(tài)學觀察和rDNA－ITS序列分析結果表明，引起廣東黃瓜褐斑病的病原菌為多主棒孢霉（Corynesporacassiicola）。本文是多主棒孢霉在廣東引起黃瓜褐斑病的首次報道。

黃瓜褐斑病； 多主棒孢霉； 病原鑒定

致 謝： 本實驗室杜振國博士和湯亞飛助理研究員在分子鑒定方面給予了熱心指導，增城市果樹蔬菜研究所肖旭林農藝師在標本采集過程中給予了熱情幫助，特此致謝。

＊ 通信作者Tel：020－87597476；E－mail：hezf＠gdppri.com

多主棒孢霉（Corynesporacassiicola）侵染引起的褐斑病是黃瓜（CucumissativusLinn.）生產上重要病害之一。目前，該病已在我國遼寧［1－2］、河南［3］、河北［4］、山東［5］、寧夏［6］、甘肅［7］和上海［8］等省市的露地及保護地黃瓜上較普遍發(fā)生，并造成嚴重損失。除黃瓜外，該病原菌還能侵染茄子［9］、番茄［10］、苦瓜［11］、煙草［12］、橡膠［13］和木薯［14］等經濟作物。多主棒孢霉主要侵染寄主植物的葉片，造成葉斑癥狀，嚴重時會造成落葉、落果等現象。

2011年5月，首次在廣東省高要市黃瓜產區(qū)發(fā)現疑似黃瓜褐斑病，生長中后期的黃瓜植株受害最為嚴重，田間病株率20%～50%，甚至100%。同年8月，在廣東省增城市黃瓜產區(qū)也發(fā)現該病害，但零星發(fā)生，危害也較輕。為了弄清該病害的病原，進而指導農民科學防治，作者對發(fā)生在廣東的疑似黃瓜褐斑病的病原進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離和純化

2011年5月和8月，分別在廣東省高要市和增城市黃瓜產區(qū)采集疑似黃瓜褐斑病癥狀的病葉，采用植物病原真菌病組織常規(guī)分離法［15］進行病原菌分離。分離的菌株單孢純化后，保存于PDA斜面上，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測定

選取高要和增城的代表性菌株各1株（編號分別為GY1和ZC1），分別接種于PDA平板上，28℃培養(yǎng)10d后用無菌水洗下分生孢子，并配成濃度為1×105個／mL的孢子懸浮液。用手持噴霧器將孢子懸浮液接種2片真葉期的黃瓜幼苗葉片（品種：‘豐研6號’，山西省夏縣良豐蔬菜研究所），以葉面布滿小水珠但不下滴為宜，接種清水作為空白對照。黑暗保濕培養(yǎng)24h后，置于28℃溫室中培養(yǎng)，接種4d后觀察發(fā)病情況，并對接種病葉組織進行病原菌再分離。試驗重復3次，每次接種10株黃瓜苗。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學觀察

將分離的病原菌株接于PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5～15d，不定期觀察菌株的菌落形態(tài)、產孢結構和分生孢子形態(tài)等特征，并測量分生孢子的大小，參照相關的文獻報道［2，8－16］，鑒定病原菌。

1.3.2 病原菌rDNA－ITS序列分析

將代表菌株GY1和ZC1接于PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)10d后，參考劉丹等報道的CTAB法［17］提取病原菌基因組DNA。以真菌通用引物ITS4和ITS5［18］進行PCR擴增。PCR反應體系（50μL）包括 DNA 模板2μL（20～30ng），引物ITS4（10μmol／L）和ITS5（10μmol／L）各2μL，Premix Ex Taq? Version 2.0 25μL（TaKaRa公司），ddH2O 19μL。PCR擴增程序：95℃預變性6min，94℃變性30s，55 ℃退火30s，72℃延伸50s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。在1%瓊脂糖凝膠上檢測PCR結果，回收PCR產物，送上海英駿生物技術有限公司測序，將所得ITS序列登錄到GenBank，并進行Blast同源性比對。

2 結果與分析

2.1 黃瓜病株田間癥狀

廣東省高要市蜆崗鎮(zhèn)露地栽培黃瓜（品種為‘豐研6號’，山西省夏縣良豐蔬菜研究所）病株癥狀表現為：葉片先出現水浸狀黃色小點，略凹陷，對光可見小點透明；病斑進一步擴展為近圓形，多數病斑受葉脈限制呈不規(guī)則形或多角形；后期病葉布滿黃色或黃褐色病斑，像一個“靶子”（圖1）。病株中下部葉片先發(fā)病，逐漸向上部葉片發(fā)展。田間有時與黃瓜霜霉病混合發(fā)生。

圖1 廣東黃瓜褐斑病田間癥狀

2.2 病原菌致病性測定結果

從高要市和增城市的黃瓜病葉中分別分離到6株和3株病原真菌，這些菌株菌落形態(tài)基本一致。從高要和增城分離的菌株中各選取1株作為代表菌株（編號分別為GY1和ZC1）進行致病性測定，結果顯示，28℃噴霧接種4d后，2個菌株均可導致黃瓜葉片正面上出現水浸狀圓形黃色小病斑，葉片背部呈現灰白色小病斑（圖2）；后期病斑逐步擴展，呈現圓形或多角形，與田間病葉癥狀相似，而清水接種的葉片沒有發(fā)病癥狀。從這些接種發(fā)病葉中重新分離到與接種菌株相同的病原菌。

2.3 病原菌形態(tài)學鑒定結果

在PDA平板上，菌落平展，灰色至淺棕色，培養(yǎng)基表面形成氈毛狀的菌絲層，后期菌株分泌黃褐色色素。分生孢子梗由菌絲衍化而來，無子座。分生孢子呈淺褐色，常單生，或2～5個串生于頂端，直立或稍彎，圓柱形或倒棍棒形，基部平截，頂部鈍圓，半透明至淺褐色，有2～8個假隔膜，大?。?5～150）μm×（4～9）μm（圖3）。各菌株的形態(tài)表現基本一致。這些特征與文獻［2，8－16］報道的黃瓜褐斑病菌基本一致，將引起廣東黃瓜褐斑病的病原菌初步鑒定為多主棒孢霉（C.cassiicola）。

2.4 病原菌rDNA－ITS序列分析結果

應用真菌18S－28SrDNA間隔區(qū)序列（ITS）的通用引物ITS4和ITS5，從菌株GY1和ZC1的DNA中分別PCR擴增到580bp左右的特異片段。序列測定結果顯示，2個特異片段長均為583bp，且兩者序列完全一致。BLAST比對結果表明，菌株GY1（GenBank登錄號：JQ595296）、ZC1（GenBank登錄號：JQ595297）與C.cassiicola菌株（AY238606和AY238605）的ITS序列同源性為100%，與C.cassiicola其他菌株（JN54124、GU461298、GU138988、FJ85275）的序列同源性達99.8%（僅1個堿基差異）。該結果進一步支持廣東黃瓜褐斑病的病原菌為多主棒孢霉（C.cassiicola）。

3 結論與討論

應用常規(guī)的植物病原真菌研究方法，從廣東黃瓜褐斑病樣組織中成功分離獲得病原菌，形態(tài)學鑒定顯示，該病原菌為多主棒孢霉（C.cassiicola），rDNA－ITS序列分析進一步支持該鑒定結果。因此，本研究將侵染引起廣東黃瓜褐斑病的病原菌鑒定為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色菌科、棒孢屬（Corynespora）的多主棒孢霉（C.cassiicola）。

在國內，由多主棒孢霉侵染引起的黃瓜葉斑癥狀的病害，不同研究者給以不同名稱，分別為黃瓜褐斑?。?－3，7，16］、黃瓜靶斑病［6，8］和黃瓜棒孢葉斑?。?］3種，但目前稱之為黃瓜褐斑病的占多數。因此，本研究中，我們也選用黃瓜褐斑病這個名稱。

早在上世紀五六十年代，我國已有多主棒孢霉侵染黃瓜的文獻報道［19］。上世紀90年代初，多主棒孢霉引起的黃瓜褐斑病在遼寧保護地大面積發(fā)生［1］。隨后的20年時間里，該病害不斷擴展，危害也日趨嚴重，但主要集中在我國北部及西北部省份，且主要發(fā)生在設施栽培的黃瓜上［8］。在廣東黃瓜產區(qū)，一直未見多主棒孢霉侵染引起的黃瓜褐斑病發(fā)生與危害報道。因此，該病害是廣東黃瓜上發(fā)生的一種新病害。

鄒慶道等［2］的研究表明，黃瓜褐斑病菌（C.cassiicola）的菌絲生長最適溫度為28℃，產孢最適溫度為30℃；在有水滴條件下，孢子在15～35℃范圍內均能萌發(fā)，說明該病菌具有喜溫好濕的特點。廣東常年高溫、高濕，氣候條件十分利于該病的發(fā)生與流行，近期的調查發(fā)現，在粵西湛江和茂名部分黃瓜產區(qū)也發(fā)生了該病害（結果未顯示），這說明該病害正在廣東省擴展蔓延，應加強監(jiān)測與防治研究。

［1］房德純，傅俊范.黃瓜褐斑病病原與發(fā)病情況調查研究初報［J］.植物保護，1994，20（3）：23－24.

［2］鄒慶道，傅俊范，朱勇，等.黃瓜褐斑病病原菌鑒定及生物學特性研究［J］.沈陽農業(yè)大學學報，2002，33（4）：258－261.

［3］劉鳴韜，田雪亮，孫化田.黃瓜褐斑病菌分生孢子萌發(fā)與侵染的研究［J］.河南農業(yè)科學，2005（11）：51－54.

［4］李寶聚，趙彥杰，于淑晶，等.2008年秋季河北青縣黃瓜棒孢葉斑病大發(fā)生［J］.中國蔬菜，2008（11）：51－52.

［5］李長松，張眉，李林，等.山東省黃瓜棒孢葉斑?。ê职卟。┎≡b定和防治［J］.中國蔬菜，2009（18）：29－33.

［6］查仙芳，朱猛蒙，王國珍，等.寧夏首次發(fā)現黃瓜靶斑病［J］.寧夏農林科技，2009（2）：40.

［7］岳宏忠.黃瓜褐斑病的識別與防治［J］.甘肅農業(yè)科技，2010（2）：50－51.

［8］曾蓉，陸金萍，戴富明.上海地區(qū)黃瓜靶斑病病原鑒定及ITS的分析［J］.上海交通大學學報（農業(yè)科學版），2011，29（4）：13－16.

［9］李明遠，李興紅，張濤濤，等.遼寧發(fā)生茄子棒孢葉斑病［J］.植物保護，2001，27（6）：48－49.

［10］高葦，李寶聚，石延霞，等.多主棒孢在黃瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化［J］.園藝學報，2011，38（3）：465－470.

［11］Li B J，Zhao Y J，Gao W，et al.First report of target leaf spot caused byCorynesporacassiicolaon balsam pear in China［J］.Plant Disease，2010，94（1）：127.

［12］關國經，張中義，梁貴林，等.貴州烤煙棒孢霉葉斑病的發(fā)生與發(fā)展［J］.煙草科技，2007（8）：56－60.

［13］潘羨心，彭建華，劉先寶，等.不同來源橡膠樹多主棒孢病菌致病性及基礎生物學特性的比較［J］.熱帶作物學報，2008，29（4）：494－500.

［14］裴月令，時濤，蔡吉苗，等.木薯棒孢霉葉斑病病原鑒定及其生物學特性測定［J］.熱帶作物學報，2011，32（4）：728－733.

［15］方中達.植病研究方法［M］.第3版.北京：中國農業(yè)出版社，1998：122－145.

［16］李龍生，李寶聚，劉永春，等.黃瓜褐斑病的診斷與防治［J］.中國蔬菜，2005（8）：49－50.

［17］劉丹，劉太國，張敏，等.小麥光腥黑粉菌冬孢子總DNA提取方法比較［J］.植物保護，2006，32（2）：93－95.

［18］White T J，Bruns T D，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal DNA genes for phylogenetics［M］∥Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，eds.PCR Protocols.San Diego：Academic Press，1990，315－322.

［19］戚佩坤，白金鎧，朱桂香.吉林省栽培植物真菌病害志［M］.北京：科學出版社，1960.

First report ofCucumissativusbrown spot disease infected byCorynesporacassiicolain Guangdong Province

Lan Guobing1，2， Tan Yaohua3， He Zifu1，2， Luo Fangfang1， Liang Lihuan3， Yu Hao1
（1.ResearchInstituteofPlantProtection，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510640，China；2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection，Guangzhou510640，China；3.GaoyaoAgriculturalTechnologyExtensionCenter，Guangdong526100，China）

Cucumber brown spot disease was observed in Gaoyao and Zengcheng of Guangdong Province in May and August，2011，respectively.The results of pathogenicity test，morphological observation and rDNA－ITS sequence comparison indicated that cucumber brown spot was caused byCorynesporacassiicolain Guangdong Province.This paper was the first report of the disease in Guangdong Province，China.

cucumber brown spot disease；Corynesporacassiicola； pathogen identification

S 436.21

B

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.043

2012－01－07

2012－02－03

國際科技合作項目（2011DFB30040）；星火計劃重點項目（2011GA780007）；廣東省科技計劃項目（2009A020101001；2009B020201004；2010B050300014）；廣東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊專項