金剛天盾液對(duì)免疫力低下小鼠免疫功能的影響

張亞茹 鄭有麗 叢峰松

上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240

用現(xiàn)代免疫學(xué)理論和技術(shù)，研究中藥對(duì)增強(qiáng)與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，這對(duì)闡明有關(guān)中醫(yī)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)有著十分重要的意義。金剛天盾液由紅腎豆、川芎、蜂膠等數(shù)種天然藥物經(jīng)科學(xué)配伍而成。已有的研究發(fā)現(xiàn)，金剛天盾液可調(diào)整機(jī)體各系統(tǒng)臟器的功能，對(duì)免疫細(xì)胞和免疫分子均有調(diào)節(jié)作用。本文研究旨在進(jìn)一步探討金剛天盾液對(duì)免疫力低下小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的分子免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 金剛天盾液由貴州天盾免疫制品公司提供;注射用環(huán)磷酰胺由上海華聯(lián)制藥有限公司提供。細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于美國(guó) R＆D公司。流式細(xì)胞儀，2000FCA，美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物 昆明系雄性小鼠30只，6-8周，體重為20±2g，由中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立與分組 將昆明系雄性小鼠隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、模型組和藥物組，每組10只?？瞻讓?duì)照組：實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中正常飼養(yǎng)不作任何處理;模型組：腹腔內(nèi)注射100 mg/kg環(huán)磷酰胺造成免疫力低下模型，1次/d，連續(xù)3天;藥物組：腹腔內(nèi)注射100 mg/kg環(huán)磷酰胺造成免疫力低下模型，1次/d，連續(xù)3天，并在造模第一天在小鼠左脛前肌涂抹給藥，0.1 mL/只，一周后加強(qiáng)免疫1次，劑量同第一次。4d后采集樣本。

1.3.2 小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)定 小鼠稱(chēng)量體重后，頸椎脫臼處死小鼠，取胸腺、脾臟稱(chēng)其濕重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)：

胸腺指數(shù)=胸腺重×1000/體重

脾指數(shù)=脾重×1000/體重

1.3.3 小鼠血清IgG，IgM水平的測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，測(cè)定小鼠血清中IgG，IgM含量。

1.3.4 小鼠脾組織T淋巴細(xì)胞及其亞群CD4+，CD8+及CD4+/CD8+的測(cè)定 無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)Hank’s液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，將細(xì)胞懸浮于1 mL的完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度1×109L-1，用微量移液器小心地將100μL充分混勻的脾細(xì)胞懸液加到進(jìn)樣管的底部，加20μL單克隆抗體，低速振蕩混勻3 S，室溫避光孵育30 min，于countler-PREP破碎紅細(xì)胞后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群含量。

1.3.5 小鼠血清IFN-Y、IL-10水平的測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，測(cè)定血清中IFN-Y、IL-10的水平。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)免疫力低下小鼠免疫器官的影響 由表1得出，與正常對(duì)照組相比，模型組脾臟和胸腺指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。與模型組比較，藥物組小鼠脾臟指數(shù)明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01，胸腺指數(shù)也有所增加，但差異不顯著。

表1 金剛天盾液對(duì)免疫力低下小鼠免疫器官重量的的影響 (n=10，mean±s)

2.2 對(duì)免疫力低下小鼠血清IgG，IgM水平的影響 由圖1得出，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清IgG，IgM水平明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。與模型組比較，藥物組小鼠血清Ig G，Ig M水平均明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01。

2.3 對(duì)免疫力低下小鼠脾組織T淋巴亞群的影響 由表2看出，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠脾臟CD4+細(xì)胞亞群百分比下降，CD8+細(xì)胞亞群百分比上升，具有顯著差異，P＜0.05，CD4+/CD8+比值明顯降低，具有極顯著性差異，P＜0.01。而藥物組能明顯抵消環(huán)磷酰胺破壞免疫力的作用，具有顯著性差異，P＜0.05。

2.4 對(duì)免疫力低下小鼠血清IFN-γ、IL-10水平的影響由圖2所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠IFN-γ明顯降低 ({＜0.01)，IL-10明顯升高。與模型組比較，藥物組小鼠IFN-γ水平明顯增加 (P＜0.01)，IL-10呈降低趨勢(shì)。

表2 金剛天盾液對(duì)免疫力低下小鼠體液T細(xì)胞亞群的的影響 (n=10，mean±SD)

3 結(jié)論

胸腺、脾臟為機(jī)體的重要淋巴器官。胸腺是T細(xì)胞發(fā)育，分化，成熟的場(chǎng)地，其結(jié)構(gòu)及功能與機(jī)體狀態(tài)緊密相關(guān)。胸腺指數(shù)的降低以及胸腺萎縮，都是小鼠以細(xì)胞免疫為主的免疫抑制的表現(xiàn)［1］。脾臟是體內(nèi)最大的外周免疫器官，脾臟的免疫細(xì)胞以B淋巴細(xì)胞為主，而B(niǎo)淋巴細(xì)胞是參與體液免疫的主要細(xì)胞，因此脾臟與機(jī)體體液免疫的關(guān)系密切［2］。胸腺指數(shù)和脾指數(shù)直觀的反應(yīng)了免疫機(jī)體功能的強(qiáng)弱［3］。本實(shí)驗(yàn)表明，金剛天盾液對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫力低下小鼠脾臟的發(fā)育有促進(jìn)作用，對(duì)胸腺的發(fā)育也有一定的促進(jìn)作用。

T淋巴細(xì)胞按其功能可分為CD4+和CD8+兩個(gè)亞群。CD4+T淋巴細(xì)胞在機(jī)體的免疫反應(yīng)中處于非常重要的中心地位，它通過(guò)分泌多種淋巴因子激活其他T、B細(xì)胞亞群及參與免疫反應(yīng)的其他細(xì)胞，使其增殖和分化，并協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的相互作用，發(fā)揮機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能［4］。CD4+/CD8+的比值上升，提示免疫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)占優(yōu)勢(shì)，而比值下降，提示免疫功能低下［1］。

本文通過(guò)對(duì)外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定，表明金剛天盾液能夠使環(huán)磷酰胺所致免疫力低下小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞的百分含量升高，使CD4+/CD8+的比值上升，提示金剛天盾液對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)起正調(diào)節(jié)作用。

IgG、IgM水平則反映了體液免疫能力［5］。本研究表明金剛天盾液促進(jìn)免疫力低下小鼠IgG、IgM分泌增加。說(shuō)明金剛天盾液不但促進(jìn)了機(jī)體細(xì)胞免疫功能的增強(qiáng)，同時(shí)對(duì)體液免疫也有促進(jìn)作用。

Th1和Th2細(xì)胞分別調(diào)控細(xì)胞和體液免疫，Th1和Th2極化是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一旦Th1和Th2細(xì)胞之間的平衡被打破，必然會(huì)使某一種免疫占據(jù)優(yōu)勢(shì)，另一種免疫處于劣勢(shì)，從而發(fā)生疾?。?］。正常狀態(tài)下，體內(nèi)Th1和Th2可同時(shí)產(chǎn)生Th1型和Th2型細(xì)胞因子。Th1細(xì)胞主要分泌 IL-2、IL-3，IFN-γ，LT，TNF-α和 GMCSF，通過(guò)促進(jìn) C T L、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活化和增殖，達(dá)到抗腫瘤，抗病毒的效果。IFN-γ是Thl的特征性細(xì)胞因子。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等Ⅱ類(lèi)細(xì)胞因子，其主要功能在于刺激 B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，并產(chǎn)生抗體，參與體液免疫。其中IL-10除了具有Th2型細(xì)胞因子作用外，又有其他的生物學(xué)作用：抑制Th1類(lèi)細(xì)胞因子的合成及其活性，尤其抑制 IFN- γ 的產(chǎn)生［2，7，8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常對(duì)照組，環(huán)磷酰胺所致免疫力低下小鼠IL-10分泌水平維持相對(duì)較高水平，IFN-γ分泌水平相對(duì)較低，提示環(huán)磷酰胺所致免疫力低下小鼠可能是以體液免疫為主。本次研究發(fā)現(xiàn)金剛天盾液號(hào)能夠降低Th2型細(xì)胞因子IL-10的合成，同時(shí)明顯增加Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的合成，使Th1和Th2細(xì)胞功能極化趨于動(dòng)態(tài)平衡。

本文通過(guò)觀察金剛天盾液對(duì)多項(xiàng)免疫指標(biāo)的影響，證明金剛天盾液可提高環(huán)磷酰胺所致免疫力低下模型小鼠的體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能，能夠糾正T淋巴細(xì)胞亞群的紊亂，使免疫力低下小鼠CD4+/CD8+比值提高至接近正常水平，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)干擾素分泌等，從而達(dá)到提高小鼠免疫功能的作用。

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