基因修飾在干細胞治療缺血性心臟病中的應用進展

楊俊杰 綜述 陳韻岱 審校

解放軍總醫(yī)院 心內科，北京 100853

缺血性心臟病嚴重威脅人類健康。隨著再生醫(yī)學發(fā)展不斷興起，干細胞治療缺血性心臟病無論在基礎研究還是臨床試驗都取得了巨大成果[1]。將干細胞移植入梗死心肌區(qū)域內用以保護瀕死心肌、促進血管新生、改善局部炎癥環(huán)境，甚至帶來后續(xù)的心肌再生，都成為干細胞治療缺血性心臟病的重要靶點。基礎研究中，大量新型干細胞，例如誘導多能干細胞(ips)、心臟干細胞(CSCs)等已被發(fā)現(xiàn)在動物心肌內具有良好的修復性能[2]。成體干細胞的臨床試驗也表明，干細胞移植無論對急性心肌梗死，還是心力衰竭，都具有治療作用[3]。盡管如此，單純干細胞移植入缺血或梗死區(qū)域，面臨細胞外基質、支持細胞或組織、氧氣和營養(yǎng)底物的缺乏，同時還有自由基、炎癥細胞和清道夫細胞等的損傷和清除，這些都導致移植后的早期細胞丟失，無法真正發(fā)揮干細胞的多能保護作用[4]?；蛐揎棡楦杉毎委熑毖孕呐K病提供了一個新的契機，無論在保護干細胞體內存活、提高干細胞輸送平臺效率還是在干細胞體內示蹤等多方面，基因修飾都發(fā)揮著重要作用[5]。另外，把細胞作為藥物遞送體，將少量經過特殊設計能夠放大旁分泌效應的細胞移植入缺血區(qū)，可以發(fā)揮更好的生物學作用和臨床療效。通過上述方法，將更多體內殘留的干細胞動員到損傷區(qū)域參與修復，可以更大限度提高干細胞移植修復心肌的臨床效果。本文就基因修飾在干細胞治療缺血性心臟病中的運用進展作一綜述。

1 干細胞基因轉導策略

通過基因修飾干細胞有多種方法。在選擇合適的基因修飾方法時，需要掌握各種基因轉導方法的特點，表達時限的要求，轉染效率的高低，以及轉染后細胞的增殖狀態(tài)?？偟膩碚f，短期基因表達可通過質粒轉導或腺病毒轉染的方式進行，而長期的基因表達則需要借助于腺相關病毒或逆轉錄病毒體系。

1.1 質粒轉導 大量研究已經表明通過轉導劑可以直接將質粒DNA導入細胞，但是這樣的轉染效率非常低，而且與轉導細胞類型有很大關系[6]。同時，導入目的基因的種類也決定了質粒轉導是否有效。有的目的基因，如分泌型的保護因子SDF-1等，利用質粒轉導方式是可行而且有效的；但是對于那些需要在靶細胞上大量表達的分子，如整合素等，這樣的質粒轉導方式無法滿足期望。

1.2 腺病毒 復制缺陷型腺病毒載體可以通過特有的共轉染體系提高多種細胞的轉染效率。腺病毒載體是去除了編碼病毒基因表達序列(E1A和E1B)而無復制能力的編碼框，它可以穩(wěn)定的整合入宿主細胞胞質中。由于其未與染色體整合，瘤變率相對較低。腺病毒對感染非增殖細胞和增殖細胞的能力是相似的。在感染效率方面，腺病毒可以提供較高的病毒滴度從而保證有效的基因轉染。在表達時限方面，腺病毒轉染最多持續(xù)2周左右，表達高峰期多位于感染第7-10天[7]。其不足則在于，腺病毒表達時限有限，無法保證長期目的基因表達，同時還有一定的免疫原型。

1.3 腺相關病毒 腺相關病毒載體不表達任何病毒基因產物，因此具有更低的免疫原型。雖然有輕微的炎癥反應，此類載體能夠保證目的基因有效和長時間的表達。增殖或非增殖細胞都可以使用該病毒載體進行轉染，且對人體沒有損害[8]。但是，其載體搭載能力受限于目的基因大小，并且由于很難大規(guī)模產出以及存在潛在的嵌入式瘤變可能，使得腺相關病毒載體的運用受到一定限制。

1.4 逆轉錄病毒 逆轉錄病毒由于精確整合入宿主染色體內，具有穩(wěn)定長期表達目的基因的能力。這類載體在體外消除具有轉染能力的基因顆粒，從而減小全身感染或宿主間傳播的幾率。盡管如此，此類載體也有一定局限：首先很難維持高濃度的病毒滴度；其次只能轉染處于增殖期的細胞；其可能引發(fā)的逆轉錄病毒載體隨機整合也帶了了宿主細胞瘤變的風險。在嚴重的免疫缺陷型疾病患者中，利用體外逆轉錄病毒轉染的造血干細胞移植曾被用于臨床試驗[9]。慢病毒載體屬于逆轉錄病毒的一種，其既可以轉染增殖細胞，也可以轉染非增殖細胞。

2 基因修飾提高細胞移植效率

在圍梗死期和缺血性心肌病期，細胞治療的作用是不同的，因此，細胞治療受制約的因素也是不一樣的?；蛑委煱悬c可以著眼于細胞移植的各個階段，協(xié)助解決制約移植治療的多個瓶頸，包括早期存活、細胞滯留和遷移、細胞功能性聚集和基質降解等。

2.1 干細胞歸巢 很多細胞趨化因子和生長因子具有將干細胞歸巢至心肌的能力，比如間質細胞來源因子-1(SDF-1)、單核細胞趨化蛋白-3(MCP-3)、生長調節(jié)原癌基因-1(GRO-1)、肝細胞生長因子(HGF)、成纖維生長因子-2(FGF-2)和胰島素樣生長因子(IGF-1)。這些不同的干細胞歸巢因子可以動員不同類型的干細胞。比如，SDF-1可以動員表達CXCR4的諸如造血干細胞(HSCs)、內皮祖細胞(EPCs)、心臟干細胞(CSCs)和特異表達該因子的間充質干細胞(MSCs)[10]，MCP-3可動員間充質干細胞[11]，GRO-1則可促使骨髓來源的EPCs歸巢[12]，而HGF、FGF-2和IGF-1能激發(fā)體內殘留的心臟干細胞歸巢[13]。同時，新近的研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF過表達可以動員VEGFR2陽性的細胞歸巢并誘導原位內皮細胞增殖參與血管新生，VEGF-165修飾后的成骨骼肌細胞移植入梗死區(qū)域可以提高血管密度并改善心臟功能。

在急性心肌梗死發(fā)生后，缺血區(qū)域可以產生大量的干細胞歸巢因子，進而動員多種類型干細胞定位至損傷的心肌組織周圍，但是這些因子的表達只能持續(xù)非常有限的時間。例如，心梗后SDF-1表達時間不超過一周，而MCP-1則不到10d。大量研究表明，通過細胞介導的基因治療，將SDF-1在心肌組織中的過表達時間延長，可以誘導移植細胞的定位、提高血管密度、激活和動員自體心臟干細胞，最終改善心臟功能。同時，過表達SDF-1受體CRCX4的間充質細胞或造血干細胞在心梗后24h移植入心臟，同樣可以提高工程化細胞的定位并提高左室功能[14]。因此，過表達干細胞動員因子的工程化細胞可以重新激發(fā)或延長骨髓來源或心臟干細胞定位至受損心肌區(qū)域的時間和程度。相反，外源性移植入體內的干細胞也可以借助過表達相關因子的受體，提高動員細胞定位至心臟組織的效率。

2.2 干細胞遷移和植入 黏附分子和整合素被用于提高干細胞的遷移和植入。利用蛋白酶類物質調節(jié)干細胞在受損心肌組織中的遷移，改善結締組織微環(huán)境從而提高干細胞的植入效率。

多種蛋白酶類可以協(xié)助干細胞在心臟組織中遷移和植入，這些也是干細胞移植前基因調控的重要靶點?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，上調纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)的表達，組織纖溶酶活性降低，粒細胞浸潤以及組織降解被有效抑制，從而使左室擴張現(xiàn)象得到有效改善。但是有研究顯示，使用序列特異性催化的DNA酶降低PAI-1表達并激活組織纖溶酶活性，可以提高外源性干細胞在梗死區(qū)域的植入能力[15]。急性心梗后抑制PAI-1表達，不僅提高了干細胞植入能力，更有效降低了心肌細胞凋亡并改善了心功能。

內皮源性一氧化氮合酶(eNOS)的表達也被認為可以增強心梗后細胞治療的療效，而且存在多種機制。就遷移和植入來說，eNOS是干細胞遷移的關鍵[16]，前者表達可以上調金屬蛋白酶(MMP-9)的表達，提高干細胞在急性心梗時期的遷移效率。有趣的是，eNOS介導MMP-9的上調是依靠雌激素來完成的，提示急性心梗的預后存在性別差異的原因。相似的是，HMG-CoA還原酶抑制，由于可提高eNOS表達，被發(fā)現(xiàn)可以提高干細胞遷移[17]。這也揭示了他汀治療使急性心?；颊呤找娴囊粋€潛在機制。有研究已經顯示，利用基因工程上調干細胞中的eNOS表達可以改善干細胞的遷移能力，而上述結果是通過修復SDF-1介導的干細胞遷移來實現(xiàn)的。將eNOS的cDNA直接導入心肌，也可以提高豬慢性缺血模型中原位內皮細胞的增殖并改善血流灌注。因此采用基因修飾技術，使用合適干細胞載體將eNOS引入梗死區(qū)域可以提高干細胞治療的療效。

整合素是位于細胞表面的重要細胞表面受體，它介導了干細胞的動員和遷移，每個細胞表面受體都是干細胞移植前使用基因增強的靶點，同時也是觀察冠心病和慢性心力衰竭等慢性炎癥性疾病是否降低這些干細胞表面抗體的研究靶點。干細胞整合素表達的基因調控有多種形式，短暫的表達可以提高干細胞植入效率，提高在受損心肌區(qū)域的細胞旁分泌功能，以及配合其他分子途徑誘導長期的細胞植入。相反，長期的整合素表達是干細胞遠期植入效率提高和功能改善的必要條件。整合素和關鍵受體是具有細胞特異性的?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，EPCs主要依靠SDF-1和CXCR4這個系統(tǒng)，而CD18和ICAM-1也是其重要的細胞表面整合素[18]。整合素類相關酶(ILK)可以上調EPCs的ICAM-1表達，而在缺氧條件下，ILK被熱休克蛋白(HSP-90)所保護，而上述保護機制是通過NFκB和HIF-1α等介導的信號傳導引發(fā)的。因此，在正常細胞中，單純提高ILK的表達足以誘導ICAM-1表達，提示這是調節(jié)整合素介導的細胞黏附和遷移的重要上游靶點。而間充質細胞并不完全依賴于SDF-1/CXCR4這個系統(tǒng)，同時也有MCP-3/CCR1，2的參與。有趣的是，間充質細胞的遷移是通過整合素β1來實現(xiàn)的，而不是整合素β1和α4，后者主要在造血干細胞來源種群干細胞中表達[19]。

2.3 細胞外基質的介導 優(yōu)化干細胞植入后的細胞外基質，也可以提高細胞治療的療效。通過組織工程優(yōu)化心肌移植物的研究，發(fā)現(xiàn)了一些誘導細胞外基質形成或重構并最終提高干細胞植入能力的關鍵因子，比如腱糖蛋白-C(Tenascin-C，TN-C)、松弛素(relaxin)和骨膜蛋白(periostin)，這些都可以并已經被用于干細胞介導的基因轉導研究。

TN-C是一種細胞外基質類分子，急性心梗后的梗死組織愈合過程中可見上述分子表達。但是該分子長期表達可導致慢性心力衰竭的發(fā)生，醛固酮類藥物可以通過下調該分子的表達改善心室重構。但是，該分子在圍梗死期中的表達被認為是正常修復的關鍵。肌成纖維細胞植入梗死區(qū)后，TN-C出現(xiàn)了表達上調。而體外研究發(fā)現(xiàn)，TN-C可以提高成纖維細胞的遷移和特異性蛋白α-SMA的表達[20]。

松弛素是一種激素類物質，包括胰島素樣肽在內的松弛素超家族可以作用于血管和心臟，通過釋放一氧化氮起到擴張血管的作用。有研究在豬的缺血再灌注模型中的再灌注期間靜脈使用松弛素，發(fā)現(xiàn)心肌壞死、凋亡和受損心肌區(qū)域白細胞浸潤等現(xiàn)象明顯改善。接受松弛素過表達細胞移植后的動物，與對照組相比，可以顯著提高血管密度和改善心臟功能[21]。

骨膜蛋白是一種分泌性的細胞外基質蛋白，在心臟的多種病理環(huán)境中發(fā)揮影響心室重構、干細胞植入和分化等作用。在受損后的成纖維細胞中正常表達，該類蛋白參與調節(jié)心肌細胞的肥厚。利用骨膜蛋白陰性表達的小鼠，研究者發(fā)現(xiàn)心臟破裂發(fā)生率增高，但是存活下來的小鼠發(fā)生較少的心臟纖維化并保存相對較好的心功能。將骨膜蛋白注射入梗死區(qū)域，可以提高心肌細胞增殖，降低心梗面積，促進血管新生并最終改善心臟功能[22]。這些基質蛋白或基質降解的調節(jié)物為基因介導技術提高干細胞移植療效提供了潛在的獨特分子靶點。

2.4 干細胞存活和移植療效 在梗死區(qū)域的存活是干細胞移植改善心功能的重要條件。早期研究利用P-Akt、Bcl-2和HO-1等因子過表達，都可以提高間充質干細胞在移植區(qū)域的存活，降低心梗面積。但是干細胞基因修飾后盡管帶來了干細胞存活和心功能的改善，卻并不認為是單純細胞數量增多的結果。有趣的是，單純使用修飾后細胞的培養(yǎng)上清注射入梗死區(qū)域，也可以同樣降低心梗面積并改善心臟功能[23]。這些結果支持了心肌修復的旁分泌假說，不僅擴大了干細胞治療基因修飾的潛在價值，還提示心肌直接修飾可以帶來與細胞治療相似的療效。

通過不同的序列分析，可以發(fā)現(xiàn)p-Akt過表達后的干細胞在多個細胞因子方面都有上調表達，這些細胞因子也被認為是基因修飾干細胞發(fā)揮強大旁分泌保護作用的原因。其中，諸如VEGF，、FGF-2、HGF和IGF-1等細胞生長因子，可以誘導心臟干細胞激活和遷移，并其在技術上都可以對干細胞進行基因修飾從而完成移植[24]。胸腺蛋白β4，可以與ILK以及PINCH形成復合體，激活處于梗死周邊區(qū)域心肌內部的Akt信號通路[25]。分泌型卷曲相關蛋白2(Sfrp 2)是介導心肌存活和修復的重要干細胞分泌型蛋白。當該蛋白被抑制時，Akt過表達的間充質干細胞移植后的心肌保護作用明顯減弱。同樣，Sfrp 2本身具備保護缺氧受損的心肌細胞，參與其中的機制包括核內及胞內連環(huán)素等物質水平的上調和激活Wnt抗凋亡信號通路等[26]。

2.5 細胞間連接 機械-電偶聯(lián)的保持和恢復，也是心梗干細胞治療的一個重要靶點。心臟猝死被認為是環(huán)路所致心律失常的結果，而瘢痕組織的產生程度與后者密切相關。相關研究發(fā)現(xiàn)，連接蛋白表達程度與心律失常程度密切相關。骨骼肌成纖維細胞和基因修飾后的骨骼肌成纖維細胞雖然可以提高心臟功能，由于缺乏連接蛋白的表達，具有潛在致心律失常作用。這些數據提示細胞治療的電生理作用和機械作用很可能是相互獨立的。過表達連接蛋白，如(connexin 40，43或45)，間充質干細胞移植后的致心律失常作用可以顯著降低。通過基因修飾干細胞移植，也許在將來可以取代或提高組織消融治療惡性心律失常的療效[27]。2.6 心肌細胞定向分化 研究干細胞定向分化的機制，并利用基因工程促進干細胞定向分化，是未來干細胞治療心臟疾病的重要前沿。目前對于諸如胚胎干細胞等在內的多種干細胞，都發(fā)現(xiàn)存在促進其定向心肌分化的機制和干預因素。對成體細胞而言，5-氮胞苷已經被公認為是體外誘導分化心肌的重要干預手段，進一步研究其中的具體機制，肯定有助于發(fā)現(xiàn)具體參與其中的關鍵因子和信號通路，并可以通過基因工程化手段，優(yōu)化干細胞移植入體內的向心肌分化和功能改善[28]。此外，利用細胞通透肽類物質(CPP)形成復合體，將目的基因(如GATA-4)導入干細胞內，可以提高目的基因表達時限，提高在梗死區(qū)域的干細胞再生效率，從而進一步改善心臟功能[29]。

3 基因修飾在干細胞攜帶下過表達保護心臟

此類方法也被稱為細胞介導的基因轉導，實際上利用細胞體外轉染后植入或注射入體內發(fā)揮該目的基因對心臟的保護，并不只適用于干細胞，但是由于干細胞具有較好的旁分泌和分化潛能，目前傾向于使用各類前體細胞攜帶過表達目的基因治療缺血性心臟病。尤其在電-機械偶聯(lián)障礙等方面，通過導入起搏相關的基因，比如β-腎上腺素能受體類蛋白，可有助于誘發(fā)產生起搏細胞[30]。而導入電壓門控通道蛋白相關基因，如特異性超極化激活的環(huán)核苷酸通道(HCN)，亦可誘導植入細胞發(fā)揮起搏功能[31]。

4 干細胞移植后的活體示蹤

干細胞移植后的活體示蹤是干細胞生物學的重要研究領域，由于其避免處死動物以及能夠實現(xiàn)在同一動物體內的動態(tài)追蹤，具有巨大的研究和運用前景。一般來講，活體示蹤需要借助無創(chuàng)影像工具，例如PET、冷激光發(fā)射接收器和MRI等。目前主要的標記方式有直接標記和間接標記兩種[32]，直接標記主要針對細胞的表面標記，其受外界因素干擾較大，示蹤的時間窗也較短。報告基因技術屬于間接標記，其主要利用基因轉導技術，將特異性報告基因片段插入細胞染色體內，使其穩(wěn)定表達該報告基因蛋白，后者在一定化學或物理條件下激發(fā)產生可接受的信號，從而達到細胞示蹤的目的。報告基因技術只特異性標記活體細胞，且不受細胞增殖影響。相關研究已經可以利用核醫(yī)學成像原理、熒光蛋白激發(fā)以及核磁信號捕捉等技術，在PET、冷激光發(fā)射接收器和MRI上分別實現(xiàn)了對干細胞移植后的動態(tài)示蹤[33]。從運用范圍來講，由于冷激光發(fā)射接收器穿透性能較弱，僅適用于小動物體內；而MRI信號捕捉過程中的細胞標記過程較為繁瑣，且敏感度受限；PET/CT雖能準確定位和量化，但花費較為昂貴。盡管如此，利用基因修飾進行干細胞示蹤研究，是明確干細胞定位、體內滯留規(guī)律以及移植后療效量化的重要手段。

5 結語

臨床前研究已經確定了干細胞治療缺血性心臟病的幾個關鍵事件：干細胞定位、植入、存活、旁分泌和分化等，這些都是干細胞基因修飾的潛在靶點。干細胞基因工程技術的不斷發(fā)展可以協(xié)助確認多種保護性因子，并進一步將后者結合干細胞移植提高治療效果。同時，利用基礎研究研制新的報告基因并修飾干細胞，有助于優(yōu)化活體示蹤，甚至達到體內細胞分化特異性水平。另外，開發(fā)出非病毒型轉染方式結合心臟組織工程技術運用于心臟的因子治療或系統(tǒng)療法，也是未來干細胞基因修飾的發(fā)展方向?？傊?，隨著研究的深入，相信會有更多的基因靶點和基因工程技術應用于缺血性心臟病的干細胞治療領域。

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