破血化瘀、填精補(bǔ)髓法對腦出血大鼠血腫周圍組織神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響

任吉祥 任洪亮 林 雪 趙建軍

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130021)

挽救出血灶血腫周圍組織內(nèi)的神經(jīng)元是腦出血治療的關(guān)鍵。神經(jīng)生長因子(NGF)與神經(jīng)元的再生和分化密切相關(guān)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)中具有促進(jìn)神經(jīng)元存活和誘導(dǎo)神經(jīng)突起生長的作用。本研究觀察破血化瘀，填精補(bǔ)髓法中藥湯劑對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠神經(jīng)系統(tǒng)體征及神經(jīng)功能缺損評分的影響，同時(shí)檢測血腫周圍組織NGF蛋白表達(dá)變化，探索破血化瘀、填精補(bǔ)髓法對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠血腫周圍組織損傷修復(fù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體重250～300 g，由吉林大學(xué)藥學(xué)院提供，大鼠許可證號:SCXK-(吉)2007-0003。破血化瘀，填精補(bǔ)髓法實(shí)驗(yàn)方劑:水蛭8 g、生大黃10 g、生蒲黃15 g、虻蟲5 g、瓜蔞20 g、三七10 g、石菖蒲15 g、龜板膠10 g，采用傳統(tǒng)煎藥方法，去渣后取藥液進(jìn)行濃縮，使1 ml藥液中含生藥1 g，4℃保存?zhèn)溆?。醒腦健神膠囊(批號:921116，吉林省中醫(yī)院制劑室)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及酪氨酸激酶受體(TrkB)免疫組化試劑盒采用中杉金橋通用型二步法檢測試劑盒(Pv6000)。大鼠腦立體定位儀(美國STOELTING公司);手持式牙科鉆(上海齒科器械廠);光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);BMJ-1型生物組織包埋機(jī)(天津航空機(jī)電有限公司);RM2235型組織切片機(jī)(德國LEICA公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 150只Wistar大鼠隨機(jī)分成7組:正常對照組6只;假手術(shù)組，模型組，受試藥高、中、低劑量組，陽性藥對照組，每組24只，除正常對照組外，其余6組又分為1、3、7、14 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。

1.2.2 模型制備 參照文獻(xiàn)〔1〕制造實(shí)驗(yàn)性腦出血模型。實(shí)驗(yàn)動物用10%水合氯醛(350 mg/kg體重)腹腔麻醉，于大鼠腹側(cè)尾根部1.5 cm處縱行切開，游離尾動脈，微量進(jìn)樣器抽取非肝素化尾動脈血50μl。調(diào)整腦立體定位儀，使大鼠俯臥位固定于立體定位儀，使前、后囟基本在同一水平面上〔2〕。沿正中線切開頭部皮膚暴露顱骨、前囟和冠狀縫。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為0點(diǎn)，于0點(diǎn)前0.4 mm、右側(cè)旁開3 mm處鉆孔，達(dá)硬腦膜表面。微量進(jìn)樣器垂直刺入顱骨外表面下6.0 mm處，將50μl動脈血注入右側(cè)尾狀核。以10μl/min的速度、約5 min全部注入。留針30 min，緩慢出針1 mm;繼續(xù)留針10 min，然后緩慢將針完全退出，骨蠟封住鉆孔。局部涂抹青霉素粉并縫合。假手術(shù)組操作過程同上，但不向腦內(nèi)注血。

1.2.3 給藥方法 正常對照組:自由飲食飲水;假手術(shù)組:生理鹽水灌胃，1 ml/100 g，1次/d;模型組:同假手術(shù)組。受試藥低劑量組:0.5 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d;中劑量組:1 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d;高劑量組:2 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d。陽性藥對照組:醒腦健神膠囊30 mg/100 g體重，溶于2 ml水灌胃，1 次/d。

1.2.4 大鼠神經(jīng)功能評分 采用 Longa〔3〕評分法。0分:沒有神經(jīng)功能缺損;1分:左側(cè)前爪不能完全伸展;2分:行走時(shí)，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒;4分:不能自發(fā)行走，有意識喪失。

1.2.5 免疫組化法測定NGF蛋白表達(dá) 大鼠以水合氯醛麻醉后，切開胸腔，剝離心臟，止血鉗夾閉下腔靜脈和胸主動脈，剪開右心耳，靜脈留置針刺進(jìn)左心室。用0.9%生理鹽水灌注，待流出清澈生理鹽水后，改用10%多聚甲醛灌注，待大鼠頸部及上肢僵硬后，斷頭取腦，腦組織沿針道前后5 mm切開，取中段部分。組織固定，梯度脫水，石蠟包埋，切片機(jī)切片。進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。根據(jù)pv6000說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)技術(shù)染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)指標(biāo)以x±s表示，組間相差顯著性采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)系統(tǒng)體征及神經(jīng)功能缺損評分 與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)病理體征，實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)左側(cè)肢體廢用的偏癱癥狀，以前肢為重，行走過程呈順時(shí)針方向追尾狀。與模型組大鼠比較，陽性藥對照組和受試藥各組大鼠在給藥1 d和3 d后上述癥狀明顯改善。到第7天基本恢復(fù)正常。見表1。

2.2 NGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 在光鏡下，假手術(shù)組、模型組、陽性藥對照組和受試藥各劑量組在腦出血1 d時(shí)神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯，均可見淡黃色NGF蛋白陽性細(xì)胞表達(dá);腦出血后3 d和7 d，水腫較前明顯吸收、消退，腫脹減輕，結(jié)締組織增生，血腫區(qū)內(nèi)NGF蛋白表達(dá)較少，可見少量NGF蛋白表達(dá);14 d后，血腫消失，NGF蛋白表達(dá)增加，血腫周圍組織見NGF蛋白陽性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)，呈現(xiàn)黃色深染。見圖1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(x ± s，n=6)

圖1 各組大鼠第14天NGF蛋白表達(dá)情況

圖2 各組大鼠1 d，3 d，7 d，14 d，NGF 細(xì)胞數(shù)目比較

在腦出血第1、3、7天，與假手術(shù)組比較，模型組NGF陽性細(xì)胞無明顯變化(P＞0.05)。在腦出血第14天，與假手術(shù)組比較，模型組NGF陽性細(xì)胞明顯增多(P＜0.01)。在給藥第1、3、7、14天，與模型組比較，陽性藥醒腦健神膠囊對損傷腦區(qū)NGF陽性細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯的影響(P＞0.05)。受試藥各劑量組在給藥第1、3、7天對腦損傷時(shí)腦區(qū)NGF陽性細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯影響(P＞0.05)。在給藥第14天，與假手術(shù)組比較，模型組NGF陽性細(xì)胞明顯增高(P＜0.01);但與第7天比較，NGF陽性細(xì)胞明顯降低。單因素方差分析表明，受試藥劑量依賴性的增加了腦損傷時(shí)腦區(qū) NGF陽性細(xì)胞數(shù)量〔F(3，28)=13.39，P＜0.01〕。進(jìn)一步分析表明，與模型組比較，受試藥高劑量和中劑量明顯增加了損傷腦區(qū)NGF陽性細(xì)胞數(shù)量(P＜0.01)，而低劑量組并沒有看到相同的效應(yīng)。見圖2。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)元損傷后極難再生，成年哺乳動物CNS軸突損傷后，由于不能進(jìn)行有實(shí)質(zhì)意義的再生往往導(dǎo)致永久性神經(jīng)功能缺失。NGF具有調(diào)節(jié)發(fā)育中神經(jīng)元存活和促進(jìn)成熟神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的作用，生物學(xué)活性分為兩種:①使神經(jīng)細(xì)胞存活率增高;②促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突起伸長〔4〕。近年研究發(fā)現(xiàn)NGF在神經(jīng)再生過程中也起著重要的促進(jìn)作用，賈杰等〔5〕發(fā)現(xiàn)急性期腹腔注射NGF可減輕大鼠腦缺血性損傷程度，并可能通過增加腦組織突觸素(Syp)的表達(dá)來促進(jìn)腦缺血性損傷后突觸的形成。侯永春等〔6〕發(fā)現(xiàn)葛根素可能通過上調(diào) NGF水平，發(fā)揮對腦缺血神經(jīng)元的保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組大鼠比較，陽性藥和破血化瘀、填精補(bǔ)髓法受試藥各劑量組大鼠在給藥1 d和3 d后可明顯改善神經(jīng)功能缺損評分。模型組、陽性藥對照組、受試藥低、中、高劑量組，在第1、3、7天，NGF陽性細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間的改變無明顯變化;在第14天，NGF的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加?？梢姡\(yùn)用破血化瘀、填精補(bǔ)髓法中藥湯劑治療腦出血大鼠可明顯減輕神經(jīng)功能缺損的癥狀，其機(jī)制可能與促進(jìn)NGF表達(dá)有關(guān)。

1 張朋奇，朱賢立，趙甲山，等.一種大鼠腦內(nèi)出血模型的建立與評價(jià)〔J〕.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2005;10(1):33-5.

2 諸葛啟釧，譯.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:15-21.

3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;2(1):84-91.

4 Mudge AW，Neurobiology.Motor neurons find their factors〔J〕.Nature，1993;363:213.

5 賈 杰，胡永善，吳 毅，等.神經(jīng)生長因子對大鼠缺血性腦損傷急性期的療效研究〔J〕.神經(jīng)損傷與功能重建，2011;6(1):1-5.

6 侯永春，嚴(yán) 孜.葛根素對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)NGF表達(dá)的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012;18(3):184-6.