衰老相關(guān)基因Klotho在小鼠心臟表達(dá)的增齡性變化

王貴華 汪 漢 孫梅芹 彭 柯 唐 兵 楊大春 楊永健 張 鑫 侯言彬 鄧玨琳

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 成都 610083)

Klotho基因與衰老和竇房結(jié)功能密切相關(guān)，三者之間可能存在一定關(guān)聯(lián)，但具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確〔1～4〕，闡明心臟Klotho基因表達(dá)有助于進(jìn)一步研究其在竇房結(jié)的功能，為病態(tài)竇房結(jié)綜合征(病竇)開辟新的治療途徑。鑒于小鼠出生后心臟Klotho基因表達(dá)的增齡性變化尚未見報(bào)道，本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測(cè)不同日齡小鼠心臟Klotho基因表達(dá)的變化，探討昆明小鼠Klotho基因的表達(dá)及其在心臟的確切定位，研究Klotho基因與心臟生長(zhǎng)發(fā)育和竇房結(jié)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1、120 d和540 d昆明小鼠各15只，2、4、7、15、30、60、180、270 d 和 360 d 昆明小鼠各 10 只，雌雄各半，昆明小鼠購(gòu)自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(批號(hào):A09-C57BL-1021)。

1.2 PCR引物 登陸GenBank(Klotho ID:16591;Klotho mRNA:NM-013823.1)獲得C57BL小鼠Klotho基因序列，由Premer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，用無RNA酶無菌雙蒸水配置成溶液，-20℃保存。

1.3 主要試劑及儀器 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，立陶宛MBI公司;Taq DNA聚合酶，北京博大泰克公司;dNTP:美國(guó)Promega公司;DNA分子量標(biāo)準(zhǔn):北京TIANGEN公司;瓊脂糖:法國(guó)BIOWEST公司;FTC2000實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀:加拿大FUNGLYN公司;PE9600DNA擴(kuò)增儀:美國(guó)PE公司;Gel Doc 1000:美國(guó)Bio-rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 昆明小鼠心臟組織總RNA的提取及鑒定 實(shí)驗(yàn)組:取1、2、4、7、15、30、60、120、180、270、360 d 和 540 d 昆明小鼠各10只，斷頸處死，快速剪取整個(gè)心臟組織;取1、180、540 d昆明小鼠各5只，處死后快速取出心臟，切除右心房后，以余下的心臟組織作為陰性對(duì)照;并取出腎臟組織作為陽性對(duì)照。按Trizol RNA分離試劑說明書操作。進(jìn)行總RNA完整性檢驗(yàn)。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA Klotho引物序列:正義鏈:5'-GTACCTGGTTGCCCACAA-3';反義鏈:5'-CTTCGAGGATTGATCCAATG-3';探針序列:5'-CTCATGCCAAAGTCTGGCATCTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度129 bp。GADPH引物系列:正義鏈:5'-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3'，反義鏈:5'-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3';探針序列:5'-FAM-ACCACAGTCCATGCCATCAC-TAMRA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度141 bp。依據(jù)以上引物及探針序列，在PCR儀上操作。

1.4.3 Klotho mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 依次進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化;對(duì)待測(cè)基因Klotho和管家基因GADPH，選擇相應(yīng)基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物和測(cè)序;Klotho mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示。多組之間采用方差分析檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD方法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 昆明小鼠心臟組織總RNA純度與完整性鑒定 提取的總RNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察可見28、18、5 S三條亮度依此遞減的清晰條帶，泳道上無明顯彌散痕跡，其中28 S與18 S條帶亮度比值約為2∶1，無蛋白質(zhì)和DNA污染。紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品的OD260/OD280結(jié)果在1.7～2.0之間，可用于cDNA的合成。

2.2 小鼠Klotho和GADPH擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定 常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定:Klotho(129 bp)和GAPDH(141 bp)擴(kuò)增片段經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示擴(kuò)增得到大約130 bp左右的片段，清晰，無雜帶，與設(shè)計(jì)的產(chǎn)物理論大小很相近。

鑒于Klotho基因主要在腎臟表達(dá)，特選取腎臟組織作為陽性對(duì)照，以切除右心房后的心臟組織作為陰性對(duì)照，不加模板cDNA作為試劑空白對(duì)照。電泳結(jié)果表明，昆明小鼠腎臟組織有Klotho基因mRNA表達(dá)，完整心臟可檢測(cè)到Klotho基因表達(dá)，切除右心房的心臟組織未能擴(kuò)增到相應(yīng)產(chǎn)物;在小鼠腎臟組織和切除右心房的心臟組織，均可檢測(cè)到內(nèi)參基因GAPDH;試劑對(duì)照組泳道上沒有明顯條帶，表明試劑沒有污染。見圖1。提示Klotho基因可能僅在右心房區(qū)域表達(dá)，在其他心房及心室不表達(dá)。

2.3 昆明小鼠心臟組織Klotho基因mRNA的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:1、2、4、7、15、30、60、120、180、270、360 和 540 d昆明小鼠心臟組織均可檢測(cè)到Klotho基因的表達(dá)，其表達(dá)量分別為:1.086±0.258;1.134±0.275;2.021±0.534;2.580±0.584;2.270±0.680;2.460±0.572;3.196±0.541;6.232±0.549;6.128±0.325;5.867±0.545;4.356±0.263;3.182±0.561。結(jié)果表明在540 d內(nèi)的昆明小鼠心臟Klotho基因mRNA基本呈持續(xù)表達(dá)狀態(tài)。出生后第1天及第2天Klotho基因的表達(dá)量均較低，與4 d后的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);在4 d后，表達(dá)呈曲線波動(dòng)，15 d時(shí)表達(dá)量降低，之后持續(xù)升高，直到120 d時(shí)，此時(shí)Klotho表達(dá)mRNA最高，與第60天(P=0.006)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;180 d(P=0.081)、270 d(P=0.052)時(shí)的表達(dá)量與120 d時(shí)的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;540 d(P=0.000)、360 d(P=0.002)時(shí)的表達(dá)量與270 d時(shí)的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明270 d之后，Klotho基因在心臟組織的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。

圖1 小鼠Klotho和GADPH的表達(dá)

3 討論

國(guó)外的研究〔4〕觀測(cè)到Klotho基因在小鼠心臟的表達(dá)局限于右心房和上腔靜脈交界處的心外膜下細(xì)胞內(nèi)，這一區(qū)域恰好對(duì)應(yīng)于竇房結(jié)區(qū)域，免疫組化及Western印跡證實(shí)小鼠心臟其他部位可能并不存在Klotho基因的表達(dá)，野生型小鼠和Klotho雜合小鼠過度運(yùn)動(dòng)后，后者竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間明顯增長(zhǎng)，讓兩種小鼠異種共生后，Klotho鼠的竇房結(jié)功能退化的癥狀也明顯好轉(zhuǎn)。最近亦有研究〔5〕認(rèn)為Klotho基因通過影響其他組織細(xì)胞的Ca2+離子通道或其他細(xì)胞因子發(fā)揮其生物學(xué)作用。以上研究和我們的研究提示Klotho基因在維持竇房結(jié)功能中有重要作用，有可能是單獨(dú)的Klotho基因通過調(diào)節(jié)K+、Ca2+或者Na+通道對(duì)竇房結(jié)功能進(jìn)行作用。

針對(duì)Klotho基因在竇房結(jié)的研究〔4〕則表明Klotho基因可能僅在竇房結(jié)周圍區(qū)域表達(dá)，且在應(yīng)激狀態(tài)下的竇房結(jié)起搏功能或者是竇房結(jié)功能異常與Klotho基因膜型mRNA表達(dá)有關(guān)。有研究表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR較印記雜交可以檢測(cè)到腎臟Klotho基因微量的表達(dá)，我們的研究運(yùn)用熒光定量PCR，證實(shí)了在Klotho基因mRNA在右心房的表達(dá)在一定年齡范圍內(nèi)隨增齡而增加，而超一定年齡范圍卻隨增齡而減弱，這也許可以解釋低于60歲的人群病竇的發(fā)病率極低的情況。

研究均認(rèn)為竇房結(jié)的衰老自成年期開始，以后隨著年齡的增長(zhǎng)以及心肌缺血變化而發(fā)生結(jié)細(xì)胞退行性變緩慢的進(jìn)行性加重，膠原纖維脂肪組織增生，在這個(gè)過程中與竇房結(jié)離子通道相關(guān)的基因如起搏電流基因的產(chǎn)物超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道蛋白2、4均隨增齡而表達(dá)呈衰減的趨勢(shì)〔6〕;Xiao等〔7〕的研究發(fā)現(xiàn)，在10歲以前，人血清的分泌型Klotho蛋白水平較低，在30～40歲左右達(dá)到高峰，而后隨著年齡的增加反而下降。這些研究都間接提示Klotho基因的表達(dá)可能不是一直呈遞增或者遞減的狀態(tài)，與我們的研究結(jié)果相吻合。實(shí)際上Klotho基因敲除后的純合子突變小鼠在應(yīng)激情況下會(huì)出現(xiàn)固定心率減慢，竇性停搏，竇房傳導(dǎo)阻滯，以及緩慢的交界性心律，直至完全性停搏。這些表現(xiàn)與病竇〔8〕極其相似，由此推測(cè)，Klotho基因突變小鼠可能能夠成為病竇的一種模型小鼠，而多數(shù)研究認(rèn)為病竇在50～79歲(即近乎人類老年期左右)之間為發(fā)病高峰期，聯(lián)系到Klotho基因突變的小鼠，推測(cè)在小鼠的老年期，Klotho基因的表達(dá)可能是呈遞減趨勢(shì)的，而在老年期之前，Klotho基因的表達(dá)似乎是呈遞增趨勢(shì)漸至高峰，此前提及的研究〔7〕也證明了這一點(diǎn)。我們推測(cè)Klotho基因的峰型的表達(dá)可能會(huì)直接或者間接作用于起搏電流基因的產(chǎn)物超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道蛋白2、4致使其表達(dá)量出現(xiàn)相應(yīng)的改變，從而引起起搏電流的改變，導(dǎo)致病竇的產(chǎn)生。

1 Wang Y，Sun Z.Current understanding of klotho〔J〕.Ageing Res Rev，2009;8(1):43-51.

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6 Yanni J，Tellez J，Sutyagin P，et al.Structural remodelling of the sinoatrial node in obese old rats〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2010;48(4):653-62.

7 Xiao N，Zhang Y，Zheng Q，et al.Klotho is a serum factor related to human aging〔J〕.Chin Med J，2004;117(5):742-7.

8 Monfredi O，Dobrzynski H，Mondal T，et al.The anatomy and physiology of the sinoatrial node——a contemporary review〔J〕.Pacing Clin Electrophysiol，2010;33(11):1392-406.