四妙勇安湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)血管新生的影響*

許穎智，張軍平，李 明，李良軍，彭 立，張光銀，楊 萃，周亞男

(1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193;2．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

四妙勇安湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)血管新生的影響*

許穎智1，張軍平2△，李 明2，李良軍2，彭 立1，張光銀1，楊 萃1，周亞男1

(1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193;2．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

目的:探討四妙勇安湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊內(nèi)血管新生的影響及作用機(jī)理。方法:隨機(jī)將40只日本大耳白兔分為對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組30只。對(duì)照組給予普通飼料，實(shí)驗(yàn)組利用復(fù)合因素制備AS易損斑塊模型，8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組、四妙勇安湯組，第24周取材。主動(dòng)脈切片進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，測(cè)量?jī)?nèi)膜厚度(IT)、纖維帽厚度(FCT)、纖維帽厚度與內(nèi)中膜厚度比(FCT/IMT)、脂核與斑塊面積比(LCA/PA);免疫組化方法檢測(cè)CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、P38 MAPK水平;RT-PCR方法檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)。結(jié)果:與模型組比較，四妙勇安組 IT降低，F(xiàn)CT、FCT/IMT增加;CD31、VEGF、P38MAPK水平及VEGF mRNA表達(dá)顯著下降。結(jié)論:四妙勇安湯可穩(wěn)定AS斑塊，抑制斑塊內(nèi)血管新生，其機(jī)制可能與抑制斑塊內(nèi)VEGF和P38MAPK表達(dá)有關(guān)。

四妙勇安;AS易損斑塊;血管新生

AS易損斑塊是急性冠脈事件及腦卒中等心腦血管事件的主要原因。在組織學(xué)角度，易損斑塊被定義為偏心性管腔分布、脂質(zhì)含量多(脂質(zhì)池 ＞40%)、炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯、纖維成分少，纖維帽薄(＜65μm)及新生血管多的斑塊［1］。斑塊內(nèi)血管新生成為AS斑塊不穩(wěn)定的重要危險(xiǎn)因素，在易損斑塊及斑塊的易損部位更為明顯，與臨床心腦血管事件的發(fā)生有很大關(guān)系。血管新生(angiogenesis)是指在原有的毛細(xì)血管基礎(chǔ)上通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生的形式生成新的毛細(xì)血管的過(guò)程。斑塊內(nèi)血管新生是在AS病變基礎(chǔ)上發(fā)生的，而新生血管又加重了AS病變，在AS斑塊的發(fā)生發(fā)展中斑塊內(nèi)血管新生可能是一個(gè)核心事件起著關(guān)鍵性作用。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)AS發(fā)病的中醫(yī)學(xué)病機(jī)認(rèn)識(shí)，就這一核心問(wèn)題展開(kāi)研究。隨著對(duì)AS發(fā)病機(jī)制的不斷深入認(rèn)識(shí)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到熱毒血瘀是AS發(fā)生發(fā)展的的主要病理因素。以往研究表明，具有滋陰活血解毒之功效的四妙勇安湯可抑制 AS的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激［2、3］。本實(shí)驗(yàn)從另一角度觀察四妙勇安湯穩(wěn)定AS斑塊的作用機(jī)理，探討其對(duì)斑塊內(nèi)血管新生的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥物 辛伐他汀:40 mg/片，5片/盒(批號(hào)07283)，杭州默沙東制藥有限公司;四妙勇安湯煎劑:金銀花 30g，玄參 30g，當(dāng)歸 20g，甘草 10g，湯液經(jīng)過(guò)旋蒸儀旋蒸濃縮至每毫升含生藥2．25g。四妙勇安湯水煎液制備工藝:前4味藥加水溫浸30min后，分別加10倍、8倍量水煎煮2次，濾過(guò)、合并濾液，14000r/min離心 15min取上清液，采用分子截留值5萬(wàn)的超濾膜進(jìn)行超濾，超濾過(guò)程中控制壓力為 0．1mPa，溫度30℃ ±1℃。四妙勇安湯水煎液質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn):金銀花(綠原酸不得少于1．5%)、玄參(哈巴俄甘不得少于0.05%)、當(dāng)歸(阿魏酸不得少于 0.05%)、甘草(甘草酸不得少于 2．0%)。

1．2 試劑

VEGF 一 抗 (C-1，SC-7296，SATA CRUZ BIOTECHNOLOGY)、CD31 一抗(JC/70A、ab958、Abcam)。

1．3 儀器

酶標(biāo)儀(Thermo MK3，上海熱電)、電泳儀(DYY-8C，北京六一儀器廠)、PCR 儀(TC-96，杭州博日科技有限公司)、紫外透射儀(UV-254，北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心)、OLYMPUS-BX40生物顯微鏡(奧林巴斯，日本)、HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司)。

1．4 方法

1．4．1 動(dòng)物分組及給藥 選用普通級(jí)雄性日本大耳白兔 40只，體重 2．2kg±0．2kg，由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組30只。所有動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)，飲水不限，自由攝食，每日每只給予150g飼料，喂養(yǎng)24周;其正常對(duì)照組動(dòng)物給予普通飼料，其他組動(dòng)物給予高脂飼料。采用高脂飲食加免疫損傷和球囊拉傷方法建立兔AS斑塊模型［4］，自8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組、四妙勇安組(簡(jiǎn)稱為模型組、辛伐組、四妙組)。各給藥組開(kāi)始給藥至24周取材，給藥量按動(dòng)物與人用藥量體表面積折算系數(shù)15換算。辛伐他汀5mg/kg/次，1次/d;四妙勇安湯按生藥量11．25g/kg/次，2 次 /d;模型組給予蒸餾水 10ml/次，2次/d。

1．4．2 標(biāo)本的收集 24周取材，用3%戊巴比妥鈉(30mg·ml－1kg－1)麻醉后將動(dòng)物固定于手術(shù)臺(tái)，取出主動(dòng)脈血管組織沿縱軸剪開(kāi)，用生理鹽水輕輕沖洗后一部分置于組織凍存管，液氮保存做PCR備用;一部分置于10%中性福爾馬林固定。

1．4．3 標(biāo)本的測(cè)定 IT、FCT、FCT/IMT、LCA/PA(%)檢測(cè):石蠟包埋，HE、Masson、油紅“O”染色，光鏡觀察病理改變，進(jìn)行圖像分析并測(cè)量 IT、FCT、FCT/IMT、LCA/PA。測(cè)量方法:每張片子選取3個(gè)低倍視野(10×10)，每個(gè)視野測(cè)3次取其平均值。

動(dòng)脈壁斑塊內(nèi) CD31、VEGF、P38MAPK檢測(cè):采用免疫組化方法，檢測(cè)分析測(cè)量各陽(yáng)性染色面積占整個(gè)場(chǎng)面積的百分比。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)不同的高倍鏡視野(10×40)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)有黃褐色或棕黃色沉淀物)的面積與整個(gè)場(chǎng)面積的百分比并取其平均值。

動(dòng)脈壁VEGF mRNA的表達(dá)測(cè)試:采用RT-PCR方法檢測(cè)，取肉眼有突起地方疑似斑塊部位進(jìn)行組織勻漿，提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以 β-actin為內(nèi)參做半定量分析。從GenBank中獲得已知的兔VEGF mRNA的序列(序列號(hào)AY196796)和兔內(nèi)標(biāo)基因序列(序列號(hào)AF598932)委托上海生工公司合成。反應(yīng)條件:93℃預(yù)變性3 min，93℃ 40 s，72℃ 40s，63℃ 40s，27Cycle，最后 72℃ 延伸 8min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物6μl在1．5%瓊脂糖凝膠上電泳 25 min，拍照留取圖像，以擴(kuò)增目的片段與β-actin的灰度比值表示所擴(kuò)增的目的基因片段的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2．1 四妙勇安湯對(duì)腹主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)影響

對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞完整，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊，呈長(zhǎng)橢圓形。模型組主動(dòng)脈見(jiàn)有典型斑塊形成，表面有纖維組織覆蓋，形成典型的較薄“纖維帽”;內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮部分脫落、不完整，內(nèi)皮下見(jiàn)脂質(zhì)、泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彈力纖維斷裂溶解，有大量膠原纖維生成。辛伐組內(nèi)膜增厚，有少量泡沫細(xì)胞形成，內(nèi)皮完整，中膜平滑肌增殖，彈力板尚完整。四妙組內(nèi)膜增厚，可見(jiàn)若干泡沫細(xì)胞，內(nèi)皮完整，中膜平滑肌增殖，排列尚規(guī)則，彈力板尚完整。

2．2 四妙勇安湯腹主動(dòng)脈內(nèi)中膜的影響

表1顯示，病理檢測(cè)結(jié)果顯示，辛伐組和四妙組IT、LCA/PA低于模型組，F(xiàn)CT、FCT/IMT均高于模型組(P ＜0.05，P ＜0．01)。

2．3 四妙勇安湯對(duì)腹主動(dòng)脈組織 CD31、VEGF、P38MAPK水平的影響

表2顯示，模型組 CD31、VEGF、P38MAPK陽(yáng)性面積百分比高于對(duì)照組;各給藥組 CD31、VEGF、P38MAPK陽(yáng)性面積百分比均低于模型組(P＜0.05 或P＜0.01)。

表1 各組血管壁IT、IT/MT、FCT、FCT/IMT比較

表2 各組主動(dòng)脈CD31、VEGF陽(yáng)性面積百分比(%)比較

2．4 四妙勇安湯對(duì)腹主動(dòng)脈VEGF mRNA表達(dá)的影響

模型組 VEGF mRNA 表達(dá)(1．39±0．38)高于對(duì)照組(0．99 ±0．27)，辛伐組和四妙組 VEGF mRNA表達(dá)分別為 1．07 ±0．36、0．64 ±0．31 均低于模型組(P ＜0.05，P ＜0．01)。

3 討論

1984年Barger等［5］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜血管生成與AS斑塊之間存在一定關(guān)系，在AS易損斑塊形成和發(fā)展中起到重要作用。AS斑塊內(nèi)新生血管由簡(jiǎn)單的內(nèi)皮細(xì)胞圍成，周?chē)鷽](méi)有支撐的結(jié)締組織，管壁發(fā)育不完善，這些血管脆性大，在周?chē)?xì)胞因子的作用下容易破裂出血，引起急性冠脈綜合征。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組腹主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、纖維帽薄、脂核面積增大，斑塊內(nèi) CD68表達(dá)增高，大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌減少;內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31陽(yáng)性面積百分比明顯增高，AS斑塊內(nèi)新生血管增加，模型組主動(dòng)脈形成易損斑塊［1］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，易損斑塊是熱毒血瘀相互交織、相互影響所致的脈絡(luò)瘀結(jié)。熱毒、痰濁、瘀血三者相互膠結(jié)沉積于虛損之絡(luò)脈，加重了脈管的損傷;日久膠結(jié)不解，凝之愈堅(jiān)，瘀結(jié)加重，形成 AS易損斑塊。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)以上病機(jī)，運(yùn)用具有解毒活血功效的四妙勇安湯對(duì)AS易損斑塊進(jìn)行干預(yù)。四妙勇安湯出自《驗(yàn)方新編》，由金銀花、當(dāng)歸、玄參、甘草4味藥組成。方中金銀花清熱解毒，玄參滋陰清熱，當(dāng)歸活血和營(yíng)，生甘草解毒、調(diào)和諸藥，全方具有清養(yǎng)結(jié)合、毒瘀并驅(qū)，共奏滋陰解毒、活血通絡(luò)之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四妙勇安湯可降低內(nèi)膜厚度、增加纖維帽厚度，使巨噬細(xì)胞、脂質(zhì)含量減少，膠原及平滑肌增多，還可降低斑塊內(nèi)CD31的表達(dá)，抑制斑塊內(nèi)血管新生，從而穩(wěn)定AS易損斑塊。為闡明其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)P38MAPK、VEGF及 VEGF mRNA表達(dá)進(jìn)行了觀察。

結(jié)果提示，模型組斑塊內(nèi) P38 MAPK和 VEGF活性增高。P38 MAPK是一種重要的蛋白酶，是成纖維細(xì)胞分泌VEGF所必需的［5］。MAPK作為轉(zhuǎn)錄因子可轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)特定基因的表達(dá)，完成VEGF相應(yīng)的促增殖作用［6］。VEGF是一種具有促進(jìn)新生血管形成和組織修復(fù)作用的血管生成因子［7］，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移、趨化，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用［8］;動(dòng)員骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)入外周循環(huán)，定位到缺血組織，在原位分化形成成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，形成新的血管［9］。本研究結(jié)果提示，四妙勇安湯具有抑制AS斑塊內(nèi)P38 MAPK活性的作用，并具有和辛伐他汀同樣的效果［10］，抑制斑塊內(nèi)VEGF蛋白和基因表達(dá)。這可能是四妙勇安湯抑制斑塊內(nèi)血管新生的機(jī)制之一。

［1］呂曉蕾，龔開(kāi)正，張振剛．對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損機(jī)制的新認(rèn)識(shí)［J］．臨床薈萃，2006，21(9):681-683．

［2］張軍平，李 明，李良軍，等．四妙勇安湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化模型兔血清 ox-LDL、NO及 MPO的影響［J］．中醫(yī)藥通報(bào)，2009，8(2):53-58．

［3］張軍平，許穎智，李 明，等．四妙勇安湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化模型氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的干預(yù)研究［J］．中醫(yī)雜志，2010，51(1):72-74．

［4］張軍平，許穎智，李良軍，等．實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化模型復(fù)合建模的方法及評(píng)價(jià)［J］．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(1):41-45．

［5］Thobe BM，F(xiàn)rink M，et al．Src family kinases regulate p38 MAPK-mediated IL-6 production in Kupffercellsfollowing hypoxia［J］．American Journal of Physiology，2006，291(4):76-82．

［6］Duyndam MC，Hulscher ST，et al．Evidence for a role of p38 kinase in hypoxia-inducible factor 1-independent induction of vascular endothelial growth factor expression by sodium arsenite［J］．Biol Chem，2003，278(68):85-95．

［7］JinX，GeX，et al Expression and function of vascular endothelial growth factor receptors(Flt-1 and Flk-1)in vascular adventitial fibroblasts［J］．Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2007，43(3):292-300．

［8］Wang Y， Haider HK， et al． Ashraf M． Combining pharmacological mobilization with intramyocardial delivery of bone marrow cells over-expressing VEGF is more effective for cardiac repair［J］．Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2006，40(7):36-45．

［9］Rehman J，Traktuev D，Li J，Merfeld-Clauss S，Temm-Grove CJ， Bovenkerk JE， et al． Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells． J．Circulation，2004，109(12):92-98．

［10］張 路，吳宗貴．辛伐他汀對(duì)家兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響［J］．第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(5):560-562．

Effects of Simiao Yongan Tang on angiogenesis in plaque of experimental artherosclerosis

XU Ying-zhi1，ZHANG Jun-ping2△，LI Ming2，LI Liang-jun2，PENG Li1，ZHANG Guang-yin1，YANG Cui1，ZHOU Ya-nan1
(1．Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin300193，China;2．The First Hospital affiliated to Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin300193，China)

Objective:To observe the effect of Simiaoyongan Decoction(SYD)on angiogenesis in rabbit’s Atherosclerosis(AS)plaque．Methods:40 Japanese white rabbits were randomly divided in two groups，that is，the control group(n=10，normal diet)and the experiment group(n=30)，in which AS vulnerable plaque model was established by feeding high-fat diet，injecting Bovine Serum Albumin(BSA)and balloon catheter overstretching on abdominal aorta artery．At the 8th week，30 animals in experiment group were randomly divided in three groups，that is，model group(n=10)，SYD group(n=10)，simvastatin group(n=10)．The rabbits were sacrificed at the 24th week．Pathological changes were observed by HE，oil red O and Masson staining，and then measured intimae thickness(IT)，fiber cat thickness(FCT)，F(xiàn)CT/IMT，lipid core area to plaque area ratio(LCA/PA)．CD31，VEGF，P38 MAPK protein were detected with immunohistochemistry(IHC)，and VEGF mRNA signal was assessed by polymerase chain reaction(PCR)．Results:IT in SYD group was lower and FCT，F(xiàn)CT/IMT levels were higher than that of the model group．Compared with the model group，the levels of CD31，VEGF，P38MAPK in the SYD group decreased，and VEGF mRNA expression was inhibited by SYD(P＜0．01or P ＜0.05)．Conclusion:SYD could suppress angiogenesis in AS plaque to stabilize AS vulnerable plaque．It may act by decreasing P38 MAPK，VEGF protein and VEGF mRNA expressions．

Si miao yong’an Decoction;angiogenesis;atherosclerosis plaque

R285．5

B

1006-3250(2012)02-0161-03

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目資助(206009);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (30901890);天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(09JCZDJC20700)

許穎智(1979-)，女，山東人，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)心腦血管疾病臨床與研究。

△通訊作者:張軍平(1965-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病的臨床與研究，E-mail:tjzhtcm@163．com。

2011-08-09