復(fù)方骨肽注射細菌內(nèi)毒素的檢查方法研究

馮 磊

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

骨肽及復(fù)方骨肽注射液均具有刺激成骨細胞增殖、調(diào)節(jié)骨代謝、促進新骨形成等多種藥理作用，復(fù)方骨肽注射液是在骨肽注射液的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，與全蝎提取液制成的復(fù)方肽類制劑，含有多種骨生長因子，具有消炎止痛，促進骨愈合、生長等作用。臨床多用于骨折和骨科手術(shù)愈合及風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性骨質(zhì)疏松等疾病的治療等[1-3]。本品現(xiàn)有的質(zhì)量標準的控制采用熱原檢查法，本研究確定了復(fù)方骨肽注射液的內(nèi)毒素檢查限值并研究其使用細菌內(nèi)毒素檢查法的可行性，為其質(zhì)量標準提高提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

細菌內(nèi)毒素測定儀，型號BET-72（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；鱟試劑（TAL，廈門鱟試劑實驗廠有限公司，批號:100420，規(guī)格1.7 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，批號 :1010142，檢測范圍 =10.00 ～ 0.03 EU/mL，1.25 mL/支）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，中國食品藥品檢定研究院，內(nèi)毒素含量＜0.005 EU/mL，規(guī)格:10 mL/支）；細菌內(nèi)毒素國家標準品（NSE，中國食品藥品檢定研究院，批號:150600-200707，10 000 EU/支）；復(fù)方骨肽注射液（常州方圓制藥有限公司，規(guī)格：5 mL∶ 75 mg，批號：20110219A，20110219B，規(guī)格：2 mL∶30 mg，20110313A，20110104A；南京新百藥業(yè)有限公司，規(guī)格：5 mL∶75 mg，批號：110301，110302，規(guī)格：2 mL∶30 mg，批號：110105，110301。其他材料：漩渦振蕩器（scientific industries），試管，移液管，試管架。試管等玻璃器皿嚴格按照《中國藥典》2005年版二部附錄“細菌內(nèi)毒素檢查法”中的相關(guān)要求經(jīng)過浸泡、沖洗、干烤除細菌內(nèi)毒素[4]。

1.2 方法

1.2.1 供試品細菌內(nèi)毒素限值（L）的確定 根據(jù)公式：L=K/M，其中M為人用每公斤體重每小時最大劑量，依據(jù)藥品使用說明書，10 mL溶于生理鹽水后靜脈滴注，則M為10 mL/h；K為按規(guī)定的給藥途徑，臨床無任何不良反應(yīng)的內(nèi)毒素閾劑量，即人用每公斤體重每小時可最大接受的內(nèi)毒素劑量，一般注射劑為5 EU/（kg·h），中國人平均體重按60 kg計。故中國人的內(nèi)毒素閾計量為300 EU/h，由于該藥需要溶解在生理鹽水內(nèi)靜脈滴注，計算時應(yīng)考慮生理鹽水所占的內(nèi)毒素量，生理鹽水的內(nèi)毒素限值為0.5 EU/mL，滴注速度一般不超過250 mL/h，代入公式計算復(fù)方骨肽注射內(nèi)毒素限值。

1.2.2 標準曲線的可靠性試驗 標準曲線系列溶液的制備：用細菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素國家標準品進行10 ～ 2倍稀釋，最終細菌內(nèi)毒素濃度分別為 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/mL稀釋系列，即λ=0.031 25 EU/mL。陰性對照：使用的內(nèi)毒素檢查用水即為陰性對照液。各取0.1mL分別加到預(yù)先加有0.1 mLTAL試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，立即插入BET-72細菌內(nèi)毒素測定儀內(nèi)進行自動檢測，其中每一個濃度重復(fù)3管，每個批號的鱟試劑進行一次可靠性試驗。

1.2.3 樣品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）計算[1]公式為：MVD=L·C·λ-1。L為復(fù)方骨肽注射液內(nèi)毒素限值，即L=17.5 EU/mL；C為1.0 mL/mL；λ為標準曲線的最低內(nèi)毒素濃度0.031 25 EU/mL；計算得復(fù)方骨肽注射液MVD。

1.2.4 干擾試驗預(yù)實驗 樣品系列溶液的制備：復(fù)方骨肽注射液用內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為 35、70、140、280、560倍溶液，記為Ai液。樣品陽性對照溶液制備：將復(fù)方骨肽注射液用內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為含有標準內(nèi)毒素λm=0.1 EU/mL的35、70、140、280、560倍樣品溶液，作為樣品添加內(nèi)毒素陽性對照管，記為Bi液。標準曲線系列溶液的制備：用細菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素國家標準品進行10 ～ 2倍稀釋，最終細菌內(nèi)毒素濃度分別為 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/mL 稀釋系列，即λ=0.031 25 EU/mL記為C液。陰性對照：使用的內(nèi)毒素檢查用水即為陰性對照液，記為D液。分別取上述各液0.1 mL，加入預(yù)先加有0.1 mL TAL試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混勻立即插入BET-72細菌內(nèi)毒素測定儀內(nèi)進行檢測，其中每一個濃度重復(fù)2管，用C液結(jié)果進行線性擬合，計算回收率?；厥章剩?）=（Bi液內(nèi)毒素值-Ai液內(nèi)毒素值）×λm×100%。每個生產(chǎn)廠家選取一批，并用每個批號的鱟試劑進行一次干擾試驗。

1.2.5 干擾試驗 選取70倍稀釋進行干擾試驗。樣品系列溶液的制備：復(fù)方骨肽注射液用內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為70倍溶液，記為Ai液。樣品陽性對照溶液制備：將復(fù)方骨肽注射液用內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為含有標準內(nèi)毒素λm=0.1 EU/mL的70倍樣品溶液，作為樣品添加內(nèi)毒素陽性對照管，記為Bi液。標準曲線系列溶液的制備：用細菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素國家標準品進行10 ～ 2倍稀釋，最終細菌內(nèi)毒素濃度分別為 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU/mL 稀釋系列，即λ=0.031 25 EU/mL記為C液。陰性對照：使用的內(nèi)毒素檢查用水即為陰性對照液，記為D液。分別取上述各液 0.1 mL，加入預(yù)先加有0.1 mLTAL試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混勻立即插入BET-72細菌內(nèi)毒素測定儀內(nèi)進行檢測，其中每一個濃度重復(fù)2管，用C液結(jié)果進行線性擬合，計算回收率。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方骨肽注射的限值

經(jīng)過計算確定為17.5 EU/mL。

2.2 標準曲線的可靠性試驗

標準曲線的可靠性試驗符合規(guī)定。見表1。

表1 標準曲線的可靠性實驗結(jié)果（n=3）

2.3 液最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

計算結(jié)果為560倍。

2.4 干擾試驗預(yù)試驗

標準曲線:安度斯鱟試劑批號1010142，lgT=3.008 78–0.360 42 lgC，r=-0.994 0。陰性對照結(jié)果符合規(guī)定。廈門鱟試劑批號 100420，lgT=2.778 62–0.291 52lgC，r=-0.997 0。陰性對照結(jié)果符合規(guī)定。

樣品的添加內(nèi)毒素平均回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，符合《中國藥典》2010年版規(guī)定，初步表明樣品的5個濃度溶液均對內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)無干擾影響。見表2。

表2 方骨肽注射液的干擾試驗預(yù)實驗回收率試驗結(jié)果（%，n=2）

2.5 干擾試驗

標準曲線:安度斯鱟試劑批號1010142，lgT=3.02120–0.312 56 lgC，r=-0.99 22。陰性對照結(jié)果符合規(guī)定。廈門鱟試劑批號 100420，lgT=2.671 20–0.296 47 lgC，r=-0.998 5。陰性對照結(jié)果符合規(guī)定。兩個生產(chǎn)廠家的8批復(fù)方骨肽注射液的回收率均在50%～200%范圍內(nèi)。見表3。

表3 復(fù)方骨肽注射液的干擾試驗預(yù)實驗回收率試驗結(jié)果（n=2）

2.6 結(jié)論

復(fù)方骨肽注射液在該實驗條件下對2個廠家的鱟試劑不存在干擾作用，該品種可以使用動態(tài)濁度法進行細菌內(nèi)毒素測定。

3 討論

細菌內(nèi)毒素檢查法與用傳統(tǒng)的家兔法檢測熱原物質(zhì)相比，操作簡單，影響因素少，不使用動物試驗，更符合3R（減少、優(yōu)化、替代）的動物福利原則。并且不需建立動物房即可進行實驗，對細菌內(nèi)毒素的靈敏度大大高于家兔法且具有非常好的重復(fù)性。在世界各國藥典中內(nèi)毒素檢查法已成為熱原物質(zhì)檢查的重要方法。復(fù)方骨肽注射液關(guān)于內(nèi)毒素檢查法的干擾試驗結(jié)果表明，復(fù)方骨肽注射液對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，可以用于日常檢驗和質(zhì)量控制。本實驗的8批次復(fù)方骨肽注射液內(nèi)毒素含量均小于4.375 EU/mL。低于限值17.5 EU/mL內(nèi)毒素含量符合規(guī)定。

細菌內(nèi)毒素檢查法分為凝膠法和光度測定法兩大類共計6種檢查法，實際檢驗時，除另有規(guī)定外，可使用任意一種方法進行檢測。凝膠法為限量和半定量檢查，而光度測定法為定量測定。在我國目前應(yīng)用最為廣泛的是凝膠法，但凝膠法由于其本身為定性試驗，不能直觀量化回收率，因此干擾試驗操作復(fù)雜，人工成本和材料成本都較高，并且無法對與鱟試劑反應(yīng)產(chǎn)生陽性的樣品進行干擾試驗的研究，具有很大的局限性。因此本研究采取了在我國光度測定法中應(yīng)用最為廣泛的動態(tài)濁度法，其在干擾試驗方面更為科學和準確。而通過本實驗確定了復(fù)方骨肽注射液可以應(yīng)用于動態(tài)濁度法，由于濁度法與凝膠法擁有相同的反應(yīng)機制，都是通過內(nèi)毒素與鱟試劑中的酶反應(yīng)產(chǎn)生凝聚同時發(fā)生濁度變化，所以本實驗的結(jié)論對于凝膠檢查法的適用性仍有參考價值。通過本研究驗證了動態(tài)濁度法在品種建立、家兔熱原檢查法轉(zhuǎn)換細菌內(nèi)毒素檢查法中的突出優(yōu)越性。

[1]段景柱，崔少千.復(fù)方骨肽注射液促進四肢骨折愈合的臨床觀察[J].實用藥物與臨床，2006，9（3）：169-170.

[2]趙剛，張士坤.應(yīng)用復(fù)方骨肽注射液治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的臨床觀察[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2009，29（6）：478-479.

[3]鄧利娟，任雪，范慧紅.骨肽及復(fù)方骨肽注射液降壓物質(zhì)的研究[J].中國生化藥物雜志，2010，31（4）:231-232.

[4]國家藥典委員會.中國藥典（2010年版）.第3部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，附錄XIIE，附錄95-98.