新城疫病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究

谷 強(qiáng)，張 偉，高志強(qiáng)，張鶴曉，劉 環(huán)，蒲 靜，喬彩霞，張利峰

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 100026）

雞新城疫是強(qiáng)毒力新城疫病毒引起的雞的急性、熱性、高度接觸性的敗血性傳染病。新城疫病毒可自然感染人、豬和犬等哺乳動(dòng)物，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)[1]。我國(guó)主要采用疫苗控制新城疫的流行，疫苗所采用的毒株大多是新城疫弱毒株。疫苗免疫后，在一定時(shí)間內(nèi)雞群中存在弱毒疫苗株，因此，快速的診斷和鑒別檢測(cè)新城疫強(qiáng)毒株和疫苗株對(duì)于防控新城疫具有十分重要意義。

隨著新城疫病毒致病力分子生物學(xué)基礎(chǔ)的深入研究，使得核酸檢測(cè)鑒別毒株毒力強(qiáng)弱成為可能。許多學(xué)者根據(jù)病毒F0切割位點(diǎn)的特定序列建立了核酸檢測(cè)方法并研制出試劑盒。目前各檢測(cè)單位在采用分子生物學(xué)方法對(duì)新城疫病毒中強(qiáng)毒株進(jìn)行鑒別檢測(cè)時(shí)，由于人員問(wèn)題、設(shè)備問(wèn)題或者采用的方法和試劑不盡相同，結(jié)果有時(shí)會(huì)有差異。因此研制相關(guān)核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過(guò)測(cè)量審核或能力驗(yàn)證的方式對(duì)設(shè)備、人員以及方法和試劑等進(jìn)行驗(yàn)證或考核具有重要意義。

本研究采用制備體外轉(zhuǎn)錄RNA制備新城疫病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不涉及生物安全問(wèn)題，在實(shí)際檢測(cè)中，可在逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增2個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量控制。一方面為相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在鑒別這2類毒株提供參比標(biāo)準(zhǔn)品，可用于評(píng)定實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷中強(qiáng)毒力新城疫病毒和新城疫病毒疫苗毒的能力。另一方面可用于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制和量值傳遞提供參比品。研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)目前已經(jīng)用于實(shí)驗(yàn)室的能力驗(yàn)證計(jì)劃和測(cè)量審核，在實(shí)踐中證實(shí)具有很好的適用性。

1 材料和方法

1.1 儀器 ROCHE公司的LightCycler 1.0，LightCycler 2.0，Roche 480熒光PCR儀，ABI7900HT熒光PCR儀。

1.2 試劑

1.3 新城疫病毒F48E9株核酸，新城疫病毒lasota株核酸，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 新城疫病毒 F48E9株和Lasota株F基因，M因和HN基因的擴(kuò)增、克隆和序列分析設(shè)計(jì)以下6對(duì)引物，用于擴(kuò)增含完整ORF的6個(gè)基因片段。

表 1 擴(kuò)增新城疫病毒F48E9，F(xiàn)基因、HN基因和M基因的引物名稱、序列

表 2 擴(kuò)增新城疫病毒Lasota，F(xiàn)基因、HN基因和M基因的引物名稱、序列

擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，將目的片段克隆入Promega公司的pGEM-T載體，挑取多個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，選取序列正確的克隆命名為pGEM-T-swF（F48E9），pGEM-T-swM（F48E9）和 pGEM-T-swHN（F48E9），pGEM-T-swF（Lasota），pGEM-T-swM（Lasota）和pGEM-T-swHN（Lasota）。

1.5 T7體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA

對(duì)上述重組質(zhì)粒序列進(jìn)行分析后，結(jié)果表明目的片段中不含有PvuII位點(diǎn)，而載體含有PvuII位點(diǎn)，因此完全酶切后，可以切出含T7啟動(dòng)子的線性化DNA片段[2]。因此選用該酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行線性化。用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；體外轉(zhuǎn)錄體系為 5×buffer 20 μL，25 mmol/L rNTPs 20 μL，線性化DNA10 μg，酶混合物10 μL，補(bǔ)加無(wú)核酸酶的水至100 μL。反應(yīng)條件為37 ℃溫浴5 h。將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后，然后用TRIZOL按照說(shuō)明重新提取RNA，以去除體系中的雜蛋白與各種離子，將RNA沉淀溶于1.0 mL的無(wú)RNA酶的滅菌水中，分裝，20 μL/管，-80 ℃凍存，即得到制備好的6種RNA片段。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品制備與初步定值

RNA的水溶液在-80℃條件下可保存一年左右，但在-20 ℃條件下只能保存一周左右，在室溫和4 ℃條件下很容易降解，我們?cè)鴩L試將不同拷貝數(shù)的RNA置于75%的乙醇溶液中，進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，取得良好效果。但由于RNA在75%的乙醇溶液中呈顆粒懸浮分散。因此其均勻狀態(tài)還可進(jìn)一步改進(jìn)，采用商品化的RNA提取裂解液TRIZOL（INVITROGEN公司產(chǎn)品）作為基質(zhì)，分散RNA，結(jié)果顯示RNA樣品4 ℃可在其中穩(wěn)定存在6個(gè)月以上。

取制備的體外轉(zhuǎn)錄RNA用無(wú)RNA酶的滅菌水分別作200倍稀釋，測(cè)定其260 nm和280 nm的吸光度值（A260和A280），計(jì)算根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用DNAMAN（Version 6）計(jì)算出單鏈模板的分子量（MW）。按照公式計(jì)算初步拷貝數(shù)[3]：拷貝數(shù)=A260×40×200× 微升數(shù) ×10-9×6.02×1023次 / MW

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，將各個(gè)片段應(yīng)用稀釋液（TRIZOL:水＝3:1）稀釋至3×108拷貝數(shù)/mL。將新城疫病毒Lasota株 M，F(xiàn)和HN 3種RNA片段和新城疫病毒F48E9株M基因，F(xiàn)基因和HN基因分別進(jìn)行等體積混合，然后分別進(jìn)行分裝，1 mL/管。

1.7 均勻性檢驗(yàn)

選擇每種標(biāo)準(zhǔn)品的M、F、HN基因作為目標(biāo)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。隨機(jī)分別抽取10管制備的標(biāo)準(zhǔn)品，加入250 μL氯仿，充分混合后，按照GB/T19438.1—2004 所述方法提取RNA。應(yīng)用建立的新城疫病毒通用熒光RT-PCR方法在重復(fù)條件下在一次試驗(yàn)中分別測(cè)試10份RNA樣品，手動(dòng)設(shè)置基線，獲取Ct值。結(jié)果數(shù)據(jù)用單因子方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.8 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

選擇每種標(biāo)準(zhǔn)品的M、F、HN基因作為目標(biāo)進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。隨機(jī)分別抽取制備的標(biāo)準(zhǔn)品，在以下每種條件下放置10支[4]：（1）室溫20~25 ℃，相對(duì)濕度20%~50%，14 d取出進(jìn)行測(cè)試；（2）冰箱冷藏溫度2~8 ℃，6個(gè)月取出進(jìn)行測(cè)試；（3）-20 ℃，1年后取出進(jìn)行測(cè)試；（4）對(duì)照，-80 ℃，長(zhǎng)期放置。將純化的質(zhì)粒pGEM-T-swM（Lasota）通過(guò)測(cè)定其260 nm和280 nm的吸光度值，通過(guò)分子量計(jì)算出其拷貝數(shù)，進(jìn)一步系列稀釋制成一系列外標(biāo)品。應(yīng)用建立的新城疫病毒通用熒光RT-PCR方法來(lái)間接測(cè)定上述RNA的拷貝數(shù)。

采用兩樣本均數(shù)顯著性檢驗(yàn)－t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定

采用委托8家外部實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定的方法來(lái)對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定值。定值方法為將純化的質(zhì)粒pGEM-T-swF（F48E9），pGEM-T-swM（F48E9）和pGEM-T-swHN（F48E9），pGEM-T-swF（Lasota），pGEM-T-swM（Lasota）和pGEM-T-swHN（Lasota）通過(guò)測(cè)定其260 nm和280 nm的吸光度值，通過(guò)分子量計(jì)算出拷貝數(shù)，進(jìn)一步系列稀釋制成一系列外標(biāo)品。應(yīng)用建立的新城疫病毒通用熒光RT-PCR方法，新城疫病毒中強(qiáng)毒力熒光RT-PCR檢測(cè)方法來(lái)間接測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

1.10 不確定度分析

通過(guò)對(duì)實(shí)際檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行分析，確定標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度。應(yīng)用A類評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)定[5]。

2 結(jié)果

2.1 新城疫病毒F48E9株 F基因、M基因和HN基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序

采用表1的引物，成功擴(kuò)增了新城疫病毒F48E9株 F基因、M基因和HN基因，見(jiàn)圖1。

擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，成功克隆入pGEM－T載體，對(duì)多個(gè)克隆測(cè)序后，選取序列正確的克隆命名為pGEM－T－swF（F48E9），pGEM－T－swM（F48E9）和pGEM－T－swHN（F48E9）。

2.2 新城疫病毒Lasota株 F基因、M基因和HN基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序

采用表2的引物，成功擴(kuò)增了新城疫病毒Lasota株 F基因、M基因和HN基因，見(jiàn)圖2。

擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，成功克隆入pGEM－T載體，對(duì)多個(gè)克隆測(cè)序后，選取序列正確的克隆命名為pGEM－T－swF（Lasota），pGEM－T－swM（Lasota）和pGEM－T－swHN（Lasota）。

2.3 T7體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA

用PvuII酶切上述質(zhì)粒，均能切出含T7啟動(dòng)子和目的DNA的片段。因此選用該酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行線性化。經(jīng)T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得大量RNA，除去其中的DNA模板后，然后用TRIZOL按照說(shuō)明重新提取RNA，獲得6種RNA片段。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品制備與初步定值

取制備的體外轉(zhuǎn)錄RNA用無(wú)RNA酶的滅菌水分別作200倍稀釋，測(cè)定其260 nm和280 nm的吸光度值（A260和A280），結(jié)果顯示A260和A280的比值均在2.0±0.1范圍內(nèi)，表明RNA純度較高。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，將各個(gè)片段應(yīng)用稀釋液（TRIZOL:水＝3:1）稀釋至3×108拷貝數(shù)/mL。將新城疫病毒F48E9株F基因、M基因和HN基因 3種RNA片段和新城疫病毒Lasota株 F基因、M基因和HN基因分別進(jìn)行等體積混合，然后分別進(jìn)行分裝，1 mL/管。

2.5 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

選擇每種標(biāo)準(zhǔn)品的M基因作為目標(biāo)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。應(yīng)用建立的新城疫病毒中強(qiáng)毒力熒光RT-PCR方法在重復(fù)條件下在一次試驗(yàn)中分別測(cè)試10份RNA樣品，手動(dòng)設(shè)置基線，獲取Ct值。結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果見(jiàn)表3，表4和圖3。

表3 新城疫病毒F48E9株標(biāo)準(zhǔn)品均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表 4 新城疫病毒F48E9株與新城疫病毒Lasota株標(biāo)準(zhǔn)品t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

按臨界值F 0.05（9、10）=3.14。計(jì)算的F值分別為0.6、0.87、0.445、2.049、2.526和1.401，該值＜F臨界值，這表明在0.05顯著性水平時(shí)，樣品中目的核酸片段含量是均勻的。

2.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

不同條件下放置制備的標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。將檢測(cè)組與對(duì)照組（-80 ℃）數(shù)據(jù)分別作兩樣本均數(shù)顯著性檢驗(yàn)－t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明檢測(cè)組與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。-20 ℃1年檢測(cè)結(jié)果平均值分別為為1.09×108拷貝數(shù)/mL和1.10×108拷貝數(shù)/mL。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

采用委托8家外部實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定的方法來(lái)對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定值。定值方法為通過(guò)制備一系列質(zhì)粒外標(biāo)品。應(yīng)用建立的新城疫病毒中強(qiáng)毒力熒光RT-PCR方法來(lái)間接測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，取平均值作為定值結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.8 不確定度分析

通過(guò)對(duì)實(shí)際檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行分析，確定標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度，包括：分析測(cè)定誤差、RNA提取過(guò)程的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。可以通過(guò)A類評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)定。協(xié)作標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)差涵蓋了以上不確定度分量。因此可作為本批標(biāo)準(zhǔn)品各個(gè)基因片段的不確定度（表5）。

表 5 新城疫病毒F48E9株與新城疫病毒Lasota株標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

雞新城疫是雞的急性、熱性、高度接觸性的敗血性傳染病。其臨床特征為敗血癥的癥候以及伴隨消化紊亂、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀。病理剖檢常出現(xiàn)消化道粘膜出血和壞死性變化。

本病于1926年首先發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞和英國(guó)的新城，故名新城疫。以后世界各地尤以亞洲各國(guó)相繼發(fā)生，為了與歐洲雞瘟相區(qū)別，故又名亞洲雞瘟，或稱偽雞瘟，我國(guó)俗稱“雞瘟”。我國(guó)把新城疫作為強(qiáng)制免疫的項(xiàng)目之一。疫苗所用的毒株為L(zhǎng)asota株。

因此在實(shí)際診斷與檢測(cè)中，采用核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒別時(shí)，必須進(jìn)行仔細(xì)的序列比對(duì)分析。

目前市場(chǎng)上雖然有許多新城疫病毒檢測(cè)試劑，但缺乏參比品進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。本研究通過(guò)選擇2個(gè)毒株最具檢測(cè)意義的全長(zhǎng)核酸片段制備標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行定值研究。均一性檢測(cè)結(jié)果選擇其中的M基因片段進(jìn)行熒光RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示瓶間變異系數(shù)分別為3.06%和3.15%，小于5%。制備的標(biāo)準(zhǔn)品在穩(wěn)定性方面，分別作了室溫14天，2~8 ℃6個(gè)月及-20 ℃保存一年的含量變化監(jiān)測(cè)，其結(jié)果與對(duì)照樣本均（-80 ℃凍存樣本）無(wú)明顯差異，表明制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以滿足實(shí)際應(yīng)用。我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理辦法規(guī)定定值結(jié)果一般表示為：標(biāo)準(zhǔn)值±總不確定度。要明確指出總不確定度的含義。本研究中標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度由以下幾部分組成：分析測(cè)定誤差、RNA提取過(guò)程的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。因此采用A類評(píng)定方法進(jìn)行了簡(jiǎn)單評(píng)定。

由于該定值制備物為RNA，在擴(kuò)增檢測(cè)中，可在逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量控制，在實(shí)際檢測(cè)中具有很好的適用性。一方面為相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室鑒別這2類毒株提供參比標(biāo)準(zhǔn)品，可用于評(píng)定實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷中強(qiáng)毒力新城疫病毒和新城疫病毒疫苗毒的能力。另一方面可為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制和量值傳遞提供參比品。因此對(duì)于進(jìn)一步推進(jìn)新城疫病毒核酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化具有重要意義。

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