中草藥提取物體外抗菌活性測(cè)定方法的初步探討

俞曉麗 王 君 聞 平

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇省鎮(zhèn)江市電力路8號(hào)，212002)

中藥藥敏試驗(yàn)方法有紙片瓊脂擴(kuò)散法、試管稀釋法、平板稀釋法、打洞法、挖溝法等，目前我國(guó)尚無(wú)統(tǒng)一完整的中藥藥敏試驗(yàn)方法，這給從事中藥新藥鑒定工作者帶來(lái)困惑。我們對(duì)幾種藥敏實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了探討，并力圖尋找一個(gè)像西藥紙片瓊脂擴(kuò)散法——Kirby-Bauer法一樣的一個(gè)統(tǒng)一且比較完善、理想的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 1)菌種:臨床分離大腸桿菌、金黃色葡萄球菌各一株。2)中藥:大蒜素獲自黑龍江寶島制藥有限公司，黃芩素獲自美國(guó)SIGMA公司，胡桃楸提取物［1］(本實(shí)驗(yàn)室自制)。3)培養(yǎng)基:試驗(yàn)中所用MH液體培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 管碟法 將試驗(yàn)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h后，用生理鹽水洗下，用比濁法配成105CFU/mL菌液，用棉簽涂抹于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，放上特制鋼杯，鋼杯內(nèi)徑0.5cm，高0.8cm，盛入不同濃度上述各種中藥原液0.157mL，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)稀釋法［2］在試管中用MH液體培養(yǎng)基將各種中藥原液稀釋為 1/2、1/4、1/8，然后加入105CFU/mL菌液0.1mL，同時(shí)設(shè)不加中藥的陽(yáng)性對(duì)照管，37℃培養(yǎng)18h觀察，以MH液體培養(yǎng)基混濁，無(wú)沉淀管判為陰性。

1.2.3 平板稀釋法 取無(wú)菌9cm平皿9個(gè)，每個(gè)加無(wú)菌生理鹽水2mL。根據(jù)培養(yǎng)皿底面上注明的藥物稀釋度，在第一個(gè)平皿原藥液2mL，混勻，取倍比稀釋藥液2mL至第二個(gè)平皿，以此類推至第8個(gè)平皿。第9個(gè)平皿不加藥做陰性對(duì)照。在上述的每個(gè)平皿中加入試管中的60℃培養(yǎng)基18mL，倒入培養(yǎng)基馬上搖勻，搖勻?yàn)轫?逆時(shí)針7次，搖勻后，平放，冷凝。使藥液濃度為1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280;用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取1環(huán)受試菌液(1MacFarland單位)劃線接種于平皿內(nèi)，于32℃溫箱培養(yǎng)48h，以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥物的最低抑菌濃度(MIC)，重復(fù)3次試驗(yàn)，以3次或2次結(jié)果相同者為報(bào)告依據(jù)［3］。9號(hào)平板為陰性對(duì)照。

1.2.4 活菌計(jì)數(shù)法 將各種中藥配制為原液、1/2液，以0.5mL/管分裝在有蓋塑料離心管中，然后在每管中加入已配好的105CFU/mL菌液0.1mL，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照。試驗(yàn)管和對(duì)照管置4℃冰箱保存。參照簡(jiǎn)易式傾注平板法的計(jì)數(shù)方法［4］，即將作用后的標(biāo)本稀釋為不同濃度，每個(gè)濃度取10μL充分涂抹于瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，換算為每毫升含有的活菌數(shù)。對(duì)照管在試驗(yàn)前，試驗(yàn)管和對(duì)照管在保存不同時(shí)間后，用加樣器取4℃下作用后的試驗(yàn)液10μL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，用接種環(huán)充分涂抹，37℃培養(yǎng)24h后用電光菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.2.5 刃天青微孔板顯色法 在96孔微孔板(Costar USA)上實(shí)驗(yàn)組加入上述細(xì)菌懸液100μL/well，再加入不同稀釋度的中藥液(100μL/well)，設(shè)不加藥的細(xì)菌對(duì)照組和無(wú)細(xì)菌的空白對(duì)照組，每個(gè)培養(yǎng)條件設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置35℃孵箱培養(yǎng)18h，每孔加入刃天青溶液(5mg/mL)10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2h后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上以492nm波長(zhǎng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光度(A值)，按下列公式計(jì)算:細(xì)菌細(xì)胞存活率［5］=實(shí)驗(yàn)組A值/藥物陰性對(duì)照組A值×100%。結(jié)果判定:根據(jù)刃天青微孔板顯色法的活菌計(jì)數(shù)，細(xì)菌存活率可套用上述公式。

細(xì)菌存活率＜30%則對(duì)該藥為高度敏感(S);細(xì)菌存活率30%～50%則對(duì)該藥為中度敏感(MS);細(xì)菌存活率＞50%則對(duì)該藥為不敏感(R)。

2 結(jié)果與評(píng)價(jià)

紙片瓊脂擴(kuò)散法中由于中藥的煎劑及其他劑型做成的液體都是懸液，藥物在固體培養(yǎng)基上擴(kuò)散受到限制，效果不好，不易得出準(zhǔn)確的結(jié)果;試管稀釋法是一個(gè)比較好的方法，但具有試驗(yàn)工作量大，操作繁瑣，一個(gè)系列稀釋度含藥培養(yǎng)基只能測(cè)一種菌，營(yíng)養(yǎng)要求高的菌無(wú)法培養(yǎng)等弊端，難以推廣;打洞法同紙片擴(kuò)散法，也因中藥煎劑都是懸液，顆粒較粗，擴(kuò)散受到限制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以控制，而在臨床上不能作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法推廣;平板稀釋法，只需制成兩個(gè)系列稀釋度含藥平板，一個(gè)稀釋度可同時(shí)測(cè)多種細(xì)菌，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確;采用活菌計(jì)數(shù)法，用中藥原液可以測(cè)出用管碟法所不能測(cè)出的中藥抑菌作用。在1/2濃度中，試管法只能測(cè)出20%試驗(yàn)藥的抑菌作用，而活菌計(jì)數(shù)法則能測(cè)出所有試驗(yàn)藥對(duì)細(xì)菌的作用。但采用活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在試驗(yàn)前需對(duì)試驗(yàn)菌在生理鹽水中存活情況進(jìn)行測(cè)定，對(duì)厭氧性的菌、營(yíng)養(yǎng)要求高的菌如肺炎球菌、腦膜炎球菌等顯然不能使用此法。試管法、平板法、管碟法抑菌效果有差異，試管法因?yàn)橹兴庮伾?，最不?zhǔn)確;平板法不能最大限度提高中藥濃度，對(duì)于高M(jìn)IC中藥測(cè)定不利;管碟法結(jié)合了試管法濃度高、準(zhǔn)確和平板法顯示穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，比較適合中藥MIC的測(cè)定。

刃天青微孔板顯色法利用活細(xì)胞線粒體酶可以將藍(lán)色的刃天青還原為粉紅色的的原理，測(cè)定細(xì)胞的代謝活性及增殖反應(yīng)，刃天青顯色法以其簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，愈來(lái)愈多地應(yīng)用于檢測(cè)各種細(xì)菌對(duì)化學(xué)藥物的敏感性［5］，是以上方法中較為理想的一種方法。

［1］聞平，陳蕾.胡桃楸提取物對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)的抑制作用.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2005，17(5)：335-338.

［2］NCCLS/CLIS.Perfrom ance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing，fifteenth informational supplement M 100-S15，125(1):44-52.

［3］楊致邦.引起醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)流行的馬紅球菌的生物學(xué)特征.中國(guó)人獸共患病雜志，1997，12(3):17-19.

［4］村中幸二.尿の定量的細(xì)菌檢查法.臨床檢驗(yàn)，1996，30:587.

［5］Sarker SD，Nahar L，Kumarasamy Y.Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth，and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.Methods，2007，42:321-4.

(2011-10-11收稿)