食品中乳酸分析方法研究

龍 梅

（赤峰學(xué)院 化學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

食品中乳酸分析方法研究

龍 梅

（赤峰學(xué)院 化學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

乳酸作為一種重要的食品添加劑，在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用.食品中乳酸含量的分析測(cè)定一直受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注.由于實(shí)際食品樣品中乳酸含量并不高，且對(duì)熱不穩(wěn)定，再加上食品樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，測(cè)定前需要復(fù)雜的樣品前處理過程，造成了測(cè)定的困難.因而高選擇性，高靈敏度地直接測(cè)定食品中乳酸含量是當(dāng)前的一個(gè)研究難點(diǎn).基于這樣的現(xiàn)實(shí)，國(guó)內(nèi)外很多研究者順應(yīng)分析化學(xué)發(fā)展的方向，開發(fā)出了一系列高效、高選擇性、高靈敏度的乳酸含量測(cè)定新方法.本文總結(jié)了最近十年來國(guó)內(nèi)外關(guān)于食品中乳酸含量測(cè)定方法的研究概況.

食品；乳酸；色譜方法；生物傳感方法；毛細(xì)管電泳方法

1 前言

乳酸作為一種含有羥基和羧基的有機(jī)酸，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中[1].自從瑞典化學(xué)家Scheele1780年從酸腐的牛奶中分離得到乳酸[2]之后，這種有機(jī)酸作為一種重要的食品添加劑[3]，在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用.例如：由于乳酸有很強(qiáng)的防腐保鮮功效，可用于飲料，食品腌制，糧食加工中，具有調(diào)節(jié)pH值、抑菌、延長(zhǎng)保質(zhì)期、調(diào)味、保持食品色澤、提高產(chǎn)品質(zhì)量等作用.乳酸獨(dú)特的酸味可增加食物的美味，在醬油、醋等調(diào)味品中加入一定量的乳酸，可保持產(chǎn)品中的微生物的穩(wěn)定性和安全性，使口味更加溫和；由于乳酸的酸味溫和適中，還可作為精心調(diào)配的軟飲料和果汁的首選酸味劑.在釀造啤酒、白酒時(shí)，加入適量乳酸既能調(diào)整pH值促進(jìn)糖化，有利于酵母發(fā)酵，防止雜菌生長(zhǎng)，提高酒類質(zhì)量，增強(qiáng)酸味和清爽口感，延長(zhǎng)保質(zhì)期.在卷煙中添加乳酸[4]可以保持煙草濕度，除去煙草中雜質(zhì)，改變口味，提高煙草檔次，乳酸還可中和尼古丁煙堿，減少對(duì)人體有害成份提高煙草品質(zhì).同時(shí)，通過乳酸菌發(fā)酵等技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)得到的天然乳酸是乳制品中的天然固有成分[5]，它有著乳制品的口味和良好的抗微生物作用，已廣泛用于調(diào)配型酸奶奶酪、冰淇淋等食品中，成為倍受青睞的乳制品酸味劑.由于乳酸既是發(fā)酵食品的風(fēng)味物質(zhì)，又是相關(guān)食品酸敗時(shí)大量產(chǎn)生的物質(zhì)，所以其含量測(cè)定對(duì)食品的風(fēng)味評(píng)價(jià)和衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)是有重要意義[6].因此，建立快速準(zhǔn)確的乳酸定量測(cè)定方法，是乳酸相關(guān)研究順利進(jìn)行的基礎(chǔ)，同時(shí)也可為相關(guān)食品的制備工藝和品質(zhì)控制提供指導(dǎo)意見.

食品中乳酸含量的分析測(cè)定一直受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注.早期的測(cè)定方法主要是酸堿滴定法[7]和EDTA滴定法[8].隨著分析科學(xué)的蓬勃發(fā)展以及人們對(duì)乳酸結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究的深入，則出現(xiàn)了多種測(cè)定方法，如高效液相色譜法[9-10,18]、氣相色譜法[11-14]、酶電極法[15]、毛細(xì)管電泳法[16-17]、電位分析法[18]、原子吸收法[19]等等.但是由于實(shí)際食品樣品中乳酸含量并不高，且其結(jié)構(gòu)對(duì)熱不穩(wěn)定[20]，加上食品樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，存在的許多結(jié)構(gòu)類似的有機(jī)酸及其他化學(xué)干擾物，測(cè)定前需要復(fù)雜的樣品前處理過程，造成了測(cè)定的困難.因而高選擇性，高靈敏度地直接測(cè)定食品中乳酸含量是當(dāng)前的一個(gè)研究難點(diǎn).基于這樣的現(xiàn)實(shí)，國(guó)內(nèi)外很多研究者順應(yīng)分析化學(xué)發(fā)展的方向，開發(fā)出了一系列高效，高選擇性，高靈敏度的乳酸含量測(cè)定新方法.本文總結(jié)了最近十年來國(guó)內(nèi)外關(guān)于食品中乳酸含量測(cè)定方法的發(fā)展概況.

2 常用檢測(cè)方法

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法分析乳酸主要通過兩種途徑實(shí)現(xiàn).第一種是先衍生后分析的方法.考慮到乳酸對(duì)熱極不穩(wěn)定，樣品需先衍生化才能進(jìn)行分析，即將乳酸酯化，把極性很強(qiáng)的乳酸及其它有機(jī)酸轉(zhuǎn)換成弱極性的酯類衍生物，用極性較弱的柱子分析，或使乳酸發(fā)生其它反應(yīng)[21].操作比較麻煩，引入誤差的因素較多.隨著氣相色譜技術(shù)的發(fā)展，填充柱氣相色譜的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了乳酸的直接測(cè)定[22].這種途徑具有速度快、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，并且廣泛用于白酒、卷煙等樣品中的乳酸含量測(cè)定.

蘇國(guó)歲，何愛民[23]用衍生化-毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜分析法測(cè)定了卷煙煙氣總粒相物中的乳酸.作者以三甲基氫氧化硫?yàn)榧柞セ噭?，正戊醇為?nèi)標(biāo)，采用CP-FFAP毛細(xì)管柱(25m×0.15mm i.d.×0.25μm d.f)和選擇離子模式，建立了卷煙煙氣總粒相物中乳酸的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法.該方法的線性范圍為0.285～0.0570mg/mL乳酸(r=0.9997)，平均回收率為97.99%，RSD為1.58%.并用該法測(cè)定了部分卷煙煙氣總粒相物中的乳酸.該方法解決了乳酸(羥基酸)不易生成揮發(fā)性酯而難以用氣相色譜法測(cè)定的問題.

程勁松、胡國(guó)棟[22]用填充柱氣相色譜法直接進(jìn)樣分析了白酒中的乳酸和脂肪酸含量.他們用了一種特殊的填料(LA填料)，將其填充到玻璃柱內(nèi)，這樣白酒就無需任何預(yù)分離處理，可直接進(jìn)樣，氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)，定量測(cè)定白酒中乳酸和主要脂肪酸的含量，白酒中醇、醛、醇等大量組分不干擾測(cè)定，樣品回收率在95%以上，方法實(shí)用、準(zhǔn)確，適用于白酒中與口味密切相關(guān)的乳酸和主要脂肪酸含量的日常質(zhì)量控制分析.

2.2 高校液相色譜法

在乳酸的測(cè)定中，高效液相色譜法目前應(yīng)用最為廣泛，樣品不需要衍生化處理，進(jìn)行簡(jiǎn)單處理后即可直接進(jìn)樣[24]，方法快速準(zhǔn)確，檢測(cè)濃度范圍寬.直接采用HPLC法，可以測(cè)定食品樣品中乳酸總量.

郭逸臻[25]等采用AS11-HC(4mm)分析柱和AG11-HC(4mm)保護(hù)柱用離子色譜法測(cè)定了白酒中乳酸的總量.鄭志[26]等用C18色譜柱、0.005M的H2SO4作流動(dòng)相、在2lOnm檢測(cè)波長(zhǎng)下，測(cè)定了發(fā)酵液中乳酸的總量.周萍等[27]高效液相色譜法測(cè)定食醋及醋粉中的醋酸和乳酸含量，采用的是C18色譜柱、pH=2.65的磷酸緩沖液，乳酸回收率為93.5%～100.2%.

由于乳酸分子內(nèi)含有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有旋光異構(gòu)現(xiàn)象，可區(qū)分為L(zhǎng)-乳酸和D-乳酸.生命系統(tǒng)調(diào)節(jié)代謝過程對(duì)立體化學(xué)是非常敏感的，一對(duì)異構(gòu)體具有不同的生物活性[2].因此L-乳酸和D-乳酸在食品中含量的準(zhǔn)確測(cè)定具有十分重要的意義.但是普通的反相高效液相色譜法只能測(cè)定乳酸總量，不能判斷D-乳酸和L-乳酸，如果要測(cè)定乳酸的光學(xué)純度，一般使用手性固定相或手性流動(dòng)相的HPLC法[26].

潘瑞花等[2]選取2,3,6三甲基-β-環(huán)糊精(TM-β-CD)作為流動(dòng)相手性添加劑，建立了采用反相高效液相色譜法分離酸奶及含乳飲料中乳酸異構(gòu)體的方法.實(shí)驗(yàn)采用hypersil ODS2-C18(250×5.0 mm，5μm)色譜柱，以 0.5mM pH 2.5的TM-β-CD(含4.5mM H2SO4)作為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm.研究了采用反相高效液相色譜法對(duì)乳酸的異構(gòu)體進(jìn)行拆分和測(cè)定的實(shí)驗(yàn)條件，樣品回收率在99.2%～100.9%之間.劉冬梅等[28]利用手性柱高效液相色譜法對(duì)泡菜中L-乳酸和D-乳酸進(jìn)行了分離和測(cè)定.選用手性配體交換柱Chirex 3126為固定相，基于流動(dòng)相中的銅離子與固定相上的青霉胺配體間交換平衡以及穩(wěn)定性來分離L-乳酸和D-乳酸.L-乳酸的回收率在99.48%～100.16%之間，D-乳酸的回收率在99.72%～100.32%之間，建立了泡菜中L-乳酸和D-乳酸含量的測(cè)定方法.潘艷虹等[29]也利用此手性柱高效液相色譜法分離并測(cè)定了酸奶及乳酸飲料中的L-乳酸及D-乳酸的含量.結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)便，樣品經(jīng)簡(jiǎn)單處理后可直接進(jìn)樣，精密度和準(zhǔn)確度高，適用于食品中L-乳酸和D-乳酸的測(cè)定.

2.3 生物傳感方法

生物傳感器具有特異性識(shí)別分子的能力，常用于特殊物質(zhì)的定性和定量分析，在食品分析領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[30].生物傳感器由分子識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換器件兩部分組成，分子識(shí)別元件所用的生物活性物質(zhì)主要有酶、微生物、動(dòng)植物組織、抗體和核酸等，而信號(hào)轉(zhuǎn)換器則是將分子識(shí)別元件進(jìn)行識(shí)別時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化轉(zhuǎn)換成可用信號(hào)的裝置，其中電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器是最主要，也是研究最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的一種[31].利用電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行與生化反應(yīng)相關(guān)的有效成分的分析和有害物質(zhì)的檢測(cè)，已在食品生產(chǎn)及安全監(jiān)督領(lǐng)域獲得了比較廣泛的應(yīng)用[32].乳酸生物傳感器是以乳酸為檢測(cè)對(duì)象的電化學(xué)生物傳感器.通過在電極表面修飾乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶等，以特定的酶促反應(yīng)來獲取乳酸含量的信息[33-36].這種分析法集酶反應(yīng)的高專一性、固定化酶的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、電化學(xué)分析快速靈敏的特點(diǎn)于一體[37].

賈正根[30]以亞鐵氰化鉀作氧化型電子受容體，在乳酸氧化酶(COD)的參與下，建立了高效，準(zhǔn)確的乳酸測(cè)定方法.該傳感器可對(duì)市售乳酸飲料中的L-乳酸進(jìn)行定量測(cè)量.將不同類的乳酸飲料加水10倍稀釋后進(jìn)行測(cè)量，所得測(cè)定結(jié)果和生物分析器測(cè)量結(jié)果進(jìn)行基本一致.

畢春元，于清琴等[38]利用SBA-40C生物傳感器測(cè)定寶石-卡本內(nèi)特干紅葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中L-乳酸含量.該傳感器的工作原理是將L-乳酸氧化酶固定后與H202電極結(jié)合構(gòu)成L-乳酸酶電極測(cè)定體系，含有乳酸樣品的底物在樣品室可透過酶膜圈的外層與固定化酶層接觸并反應(yīng)，反應(yīng)放出的H2O2與白金-銀電極接觸，并產(chǎn)生電流信號(hào)，該電流信號(hào)與底物濃度成線性比例關(guān)系。利用此方法可以快速測(cè)定發(fā)酵過程中的L-乳酸含量，從而有效進(jìn)行發(fā)酵過程的監(jiān)控及終點(diǎn)判斷，為今后發(fā)酵工程技術(shù)進(jìn)一步的開發(fā)與研究提供了便利的條件.

2.4 毛細(xì)管電泳方法

毛細(xì)管電泳法是近二十年來迅速發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù)，具有高效快速、高自動(dòng)化、無污染、樣品用量少、運(yùn)行費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，受到廣大分析工作者的喜愛.目前，此方法主要用于乳制品中乳酸含量的檢測(cè).

唐萍等[16]運(yùn)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳模式，在磷酸緩沖液中成功地實(shí)現(xiàn)了蘋果酸、乳酸等9種有機(jī)酸的分離測(cè)定.研究了緩沖液濃度、pH值、電泳電壓、檢測(cè)波長(zhǎng)等因素對(duì)分離的影響，并對(duì)實(shí)際乳酸發(fā)酵液樣品進(jìn)行分析測(cè)定，檢測(cè)了其中琥珀酸、檸檬酸、乙酸、乳酸等有機(jī)酸的含量，加標(biāo)回收率為97.5%～107.1%.該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適于整個(gè)發(fā)酵過程條件的優(yōu)化及發(fā)酵產(chǎn)物的監(jiān)控工作.

陳炯炯[17]等建立了測(cè)定酸奶中乳酸含量的間接紫外檢測(cè)毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法.在未涂漬的石英毛細(xì)管(內(nèi)徑 75μm，有效長(zhǎng)度 50cm)中，以 10.0 mM的2,6-吡啶二羧酸-0.5mM十六烷基三甲基溴化銨(pH3.5)為運(yùn)行電解質(zhì)，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，在-15kV分離電壓下酸奶中乳酸6min內(nèi)能得到分析.方法重現(xiàn)性好，遷移時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1.0%和2.0%以內(nèi).在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，峰面積與樣品濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.該法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，為測(cè)定酸奶中乳酸含量提供了一種高效、快速、簡(jiǎn)便的方法.

2.5 其他方法

乳酸含量的測(cè)定還有其它方法，比如EDTA滴定法、原子吸收法等等.

EDTA滴定法是以絡(luò)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的測(cè)定乳酸含量的方法，它的原理是樣品的乳酸與過量Ca-CO3形成乳酸鈣后，用EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定乳酸鈣中所含有的鈣，通過樣品中乳酸與鈣定量反應(yīng)的關(guān)系，間接計(jì)算出乳酸含量.由于這種方法簡(jiǎn)單，快速，重復(fù)性好，投入成本低，很多生產(chǎn)廠家都使用.鄭志等[8]用此方法測(cè)定了發(fā)酵液中乳酸的含量.有資料表明，發(fā)酵液中除乳酸外，還含有乙酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸等有機(jī)酸，這使得測(cè)定的結(jié)果反映的是這些能和CaCO3反應(yīng)的各種有機(jī)酸的總量，而不僅僅是乳酸的含量，即測(cè)定結(jié)果偏高，要想得到乳酸的真實(shí)含量，還需要進(jìn)行校正.

原子吸收法是測(cè)定金屬元素的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法，用原子吸收法可間接測(cè)定乳酸的含量.孫為德[39]等用原子吸收法測(cè)定了牛奶中的乳酸含量.實(shí)驗(yàn)中使用Cu3(PO4)2懸浮液同乳酸作用，乳酸同Cu3(PO4)2中的Cu配合，釋放出PO43-，然后離心沉降未反應(yīng)的Cu3(PO4)2，用原子吸收法測(cè)定溶液中的Cu，可間接測(cè)定乳酸的含量.

3 小結(jié)

乳酸廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中，對(duì)乳酸的測(cè)定一直受到國(guó)內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注.目前，乳酸的測(cè)定方法有很多，但是每種方法都有其自身的適應(yīng)范圍和準(zhǔn)確度，都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，容易受到方法的成本及對(duì)檢測(cè)速度要求的影響，使得各自的應(yīng)用領(lǐng)域也不盡相同.例如，EDTA滴定法簡(jiǎn)單快速，但其他有機(jī)酸的存在干擾其測(cè)定，使測(cè)定結(jié)果偏高，并且不能區(qū)分乳酸異構(gòu)體.酶電極法需要使用乳酸脫氫酶膜片，該膜片價(jià)格昂貴，而且壽命一般只有幾天.氣相色譜法測(cè)定需要將樣品進(jìn)行衍生化處理，操作復(fù)雜，引入誤差的幾率增多.由于乳酸紫外吸收極其微弱，以HPLC法在210nm檢測(cè)，靈敏度很低，且樣品前處理復(fù)雜，對(duì)雜質(zhì)含量高的樣品，即便進(jìn)行樣品處理，色譜柱也很容易污染.色譜直接進(jìn)樣法測(cè)定白酒中的乳酸在理論上是一種最快、最準(zhǔn)確的方法，但到目前為止，還沒有真正找到一根既經(jīng)濟(jì)、分離效果又好、經(jīng)久耐用，且較易制備的色譜柱[40].毛細(xì)管電泳法作為一種新型分離技術(shù)，具有高效、快速、運(yùn)行費(fèi)用低等特點(diǎn)，但是目前也僅限于實(shí)驗(yàn)室測(cè)定階段，無法實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè).原子吸收法可間接測(cè)定乳酸，但乳酸樣品仍需前處理.因此，建立一套快速、準(zhǔn)確、成本低的乳酸定量測(cè)定方法，是乳酸相關(guān)研究順利進(jìn)行的基礎(chǔ)，是食品科學(xué)發(fā)展的必然需求，同時(shí)也是食品分析行業(yè)亟待解決的重大難題之一.同時(shí)，對(duì)乳酸異構(gòu)體進(jìn)行拆分研究，建立快速、靈敏、分離性能好的乳酸對(duì)映體測(cè)定方法也具有重要的理論及實(shí)際意義.

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