根霉菌反應(yīng)分離耦合生產(chǎn)有機酸的研究進展

陸君潔 ，萬永軍 ，付永前 ★

（1.臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州 318000 2.臺州金晟環(huán)保制品有限公司，浙江 仙居 317300）

0 引言

生物反應(yīng)/分離耦合過程（Integrated Bioreaction-Seperation Process），被 A.Freeman［1］稱為原位產(chǎn)物分離過程（In Situ Product Removal，簡稱ISPR），是興起于二十世紀六十年代末的一項正在迅速發(fā)展的新技術(shù)，是指在生物反應(yīng)發(fā)生的同時，選擇一種合適的分離方法及時地將對生物反應(yīng)有抑制或毒害作用的產(chǎn)物或副產(chǎn)物選擇性地從生產(chǎn)性細胞或生物催化劑周圍原位移走。其優(yōu)點突出表現(xiàn)在：①、在線分離出發(fā)酵產(chǎn)物可解除生物反應(yīng)過程中普遍存在的產(chǎn)物抑制，提高反應(yīng)速率；②、簡化產(chǎn)物分離過程的投資和操作費用；③、易于實現(xiàn)生產(chǎn)全過程的連續(xù)化和自動化。

根霉菌（Rhizopus species）具有發(fā)酵產(chǎn)物光學純度高、產(chǎn)酸能力強、營養(yǎng)要求簡單、產(chǎn)物容易提純等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于L-乳酸和富馬酸的發(fā)酵生產(chǎn)中［2-4］。根霉菌并不是一種能耐受高酸度的微生物，因此在有機酸的發(fā)酵過程中進行有效的pH控制就顯得非常重要。較常用的pH控制方法是添加堿性物質(zhì)如各種碳酸鹽、碳酸氫鹽、氫氧化物及氨水等，其中CaCO3是最常用的中和試劑。然而，使用CaCO3作中和試劑存在提取工藝流程長、消耗工業(yè)原料多以及回收率低，同時還會產(chǎn)生大量的廢渣（CaSO4）和廢水，環(huán)保壓力較大，能耗高［5］。針對上述問題，科研工作者研究使用其他中和試劑來替代CaCO3，如Na2CO3、NaHCO3、Ca（OH）2、（NH4）2CO3以及 KOH 與 K2CO3的混合物等［6］，但采用這些中和劑時，有機酸的產(chǎn)量以及生產(chǎn)強度均比使用CaCO3做中和試劑時要低，其原因主要是可溶性的有機酸鹽隨著發(fā)酵的進行會表現(xiàn)出很強的抑制效應(yīng)，嚴重阻礙了菌體的生長和產(chǎn)物的進一步生成［7］?；谝陨显颍苑磻?yīng)/分離耦合過程為技術(shù)平臺發(fā)酵生產(chǎn)包括富馬酸、乳酸等在內(nèi)的各種重要有機酸勢必會成為日后有機酸生產(chǎn)行業(yè)研究的重點。

1 反應(yīng)/分離耦合技術(shù)的概述

有機酸的發(fā)酵生產(chǎn)乃至其它生物化工過程中普遍存在著生產(chǎn)效率低、回收成本高等問題，經(jīng)濟可行性成為這些生物化工過程應(yīng)用和進一步推廣的主要障礙。其主要原因在于許多生物反應(yīng)都存在著嚴重的產(chǎn)物抑制，造成生物反應(yīng)過程的反應(yīng)速率低、底物利用率低及反應(yīng)體系中最終產(chǎn)物濃度低，加大了產(chǎn)品分離的難度和分離過程的投資和操作費用。可見，提高生產(chǎn)效率、降低回收成本的關(guān)鍵在于消除生物反應(yīng)過程中存在的產(chǎn)物抑制，而解決的辦法之一就是將生物反應(yīng)與分離過程更加緊密而有機的結(jié)合，在生物反應(yīng)進行的同時從反應(yīng)體系中及時分離出抑制產(chǎn)物，正是基于這一思想，生物反應(yīng)與分離耦合過程的研究方興未艾，成為生物化工研究的熱點之一［8］。

生物反應(yīng)與分離耦合過程的研究最早興起于六十年代末，當時的研究大多數(shù)是針對可揮發(fā)性初級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)體系，其中主要采用基于產(chǎn)物揮發(fā)性的分離方法如真空蒸發(fā)、氣提等，進行產(chǎn)物的在線分離［9］，但這類產(chǎn)物的生產(chǎn)并不能充分體現(xiàn)耦合過程的優(yōu)越性，同時這些工藝本身由于存在諸多缺陷而至今難以實現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)上的推廣與應(yīng)用；進入八十年代以來，研究重心逐漸轉(zhuǎn)移到非揮發(fā)性初級代謝產(chǎn)物的耦合過程上，在這一時期，耦合過程的工藝日趨成熟，形式也更趨多樣化，相對于原位耦合過程而言，異位耦合過程引起了更大的重視；進入九十年代以后，發(fā)酵與分離耦合技術(shù)的應(yīng)用面更趨廣泛，分離手段更多，工藝更先進，應(yīng)用體系已擴大到包括微生物次級代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)，動植物細胞培養(yǎng)等［10］。九十年代初期，根霉菌利用該技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)有機酸的研究開始引起研究者的關(guān)注，在將近20年的研究歷程中，逐漸開發(fā)了基于萃取、膜分離、吸附等分離手段的根霉菌生產(chǎn)有機酸的反應(yīng)分離耦合工藝。

2 根霉菌反應(yīng)/分離耦合制備有機酸工藝的研究

根霉菌是一類典型的絲狀真菌，傳統(tǒng)的根霉菌發(fā)酵生產(chǎn)有機酸，多利用游離的米根霉菌絲在生物反應(yīng)器中進行發(fā)酵，根霉菌的菌絲發(fā)達，在反應(yīng)器中易形成大的菌絲團，引起氧氣及其它營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞困難，或纏繞在攪拌槳上，使攪拌阻力增加，使得產(chǎn)物生成速率低、得率低、生產(chǎn)不穩(wěn)定，因此，根霉菌的反應(yīng)分離耦合體系一般較為復(fù)雜，要實現(xiàn)反應(yīng)分離耦合技術(shù)在根霉菌生產(chǎn)有機酸的工業(yè)化應(yīng)用，須從以下三個關(guān)鍵技術(shù)進行優(yōu)化與集成：①、適于耦合體系根霉菌的固定化技術(shù)；②、適于耦合體系根霉菌發(fā)酵的生物反應(yīng)器的研究；③、適于耦合體系的分離技術(shù)。

2.1 根霉菌固定化技術(shù)的研究

所謂固定化技術(shù)就是將生物催化劑限制在一定的空間范圍內(nèi)并保持所需的生物催化活性。細胞固定化方法有很多，Karel等將其歸納為四大類：表面附著、多孔介質(zhì)包埋、隔離和自聚集。而使用根霉菌固定化主要集中于載體固定化［11］（凝膠包埋法、吸附法）和無載體自固定化（自聚集）技術(shù)的研究。

2.1.1 載體固定化

載體固定化技術(shù)即是將根霉菌菌體固定在不同載體材料上，在選用載體材料時，研究者大多數(shù)開始使用軟凝膠，如海藻酸鈣等。然而，根霉菌在固定化顆粒內(nèi)部的分布并不像細菌和酵母那樣均勻，同時，海藻酸鈣在生產(chǎn)過程中，存在凝膠顆粒易發(fā)生破損、軟化等問題，使得凝膠顆粒的穩(wěn)定性和機械強度相對較差，不利于固定化細胞的多次利用；鑒于海藻酸鈣的不足，有的學者使用對根霉菌具有吸附性的載體進行菌體固定化技術(shù)的研究。如Sun等［12］應(yīng)用該技術(shù)固定化根霉菌在氣升式反應(yīng)器發(fā)酵與離子交換樹脂分離生產(chǎn)乳酸，并建立了耦合模型。載體固定化所用載體范圍很廣，從天然惰性材料如粘土、氧化鋁等，到人工合成的樹脂、多層纖維、尼龍等網(wǎng)狀織物，甚至一些天然生物質(zhì)材料如各種植物的種子、玉米棒芯、蔗渣等。雖然用于米根霉固定化發(fā)酵生產(chǎn)有機酸的載體種類相對比較多，但是很少能優(yōu)化出用于大規(guī)模生產(chǎn)并創(chuàng)造出良好的經(jīng)濟效益的載體規(guī)格，同時載體材料的使用隨之帶來了許多細胞生理、生態(tài)、工藝、工程和經(jīng)濟方面的問題，因此載體固定化米根霉發(fā)酵生產(chǎn)有機酸技術(shù)較難實現(xiàn)于大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。

2.1.2 自固定化技術(shù)

自固定化技術(shù)是指利用某些具有較強自身絮凝能力的菌株形成顆粒，以此作為一種固定化細胞的方法。根霉菌具有較強的自吸附能力，在發(fā)酵液中能形成多種不同的菌體形態(tài)（球狀、絮狀及團塊狀等），其中球狀菌體因其在傳質(zhì)傳氧、產(chǎn)物分離及重復(fù)利用等方面的優(yōu)勢而成為根霉菌發(fā)酵產(chǎn)有機酸的首選。如：Fu等［13］成功實現(xiàn)了攪拌式反應(yīng)器的逐級放大米根霉菌球形態(tài)控制工藝，可使菌絲體形成直徑約1.2mm的小球。然而，目前鮮有利用自固定化根霉菌細胞反應(yīng)分離耦合制備有機酸的文獻報導，其主要是因為影響菌體生長形態(tài)的因素很多，包括：培養(yǎng)基組成、初始pH、接種物、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵罐形狀、攪拌供氣系統(tǒng)、培養(yǎng)方式、發(fā)酵液粘度等。如何穩(wěn)定地獲得形態(tài)均一、大小合適、活力強勁的自固定化細胞仍是當前需要攻克的技術(shù)難題。另外，由于種子培養(yǎng)過程的可分析參數(shù)較少，種子的內(nèi)在質(zhì)量難于控制，多是根據(jù)發(fā)酵的最終結(jié)果來判斷，相對于發(fā)酵過程的研究而言，針對種子培養(yǎng)的系統(tǒng)優(yōu)化還有待于進一步的研究。但是，自固定化根霉菌技術(shù)的實現(xiàn)，將有效解決絲狀真菌發(fā)酵過程中形態(tài)控制難的問題，提高發(fā)酵過程的傳質(zhì)、傳氧及傳熱效率，降低產(chǎn)物分離難度，強化生產(chǎn)強度，減少生產(chǎn)成本。

2.2 生物反應(yīng)器的研究

利用生物催化劑進行反應(yīng)的生物反應(yīng)器，在生物過程中為細胞代謝提供了一個適宜的物理及化學環(huán)境，促使細胞更好生長，并得到更多的生物量或代謝產(chǎn)物，是實現(xiàn)生物技術(shù)產(chǎn)品工業(yè)化的關(guān)鍵設(shè)備。固定化細胞生物反應(yīng)器大致可以分為嫌氣型和通風型兩大類［14］，嫌氣型的有固定床、流化床、中空纖維膜反應(yīng)器等，通風型的有攪拌式、氣升式、轉(zhuǎn)盤式等［15］。根據(jù)根霉菌好氧發(fā)酵的特點，研究者采用的生物反應(yīng)器多采用通風型的氣升式、轉(zhuǎn)盤式和攪拌式等。

氣升式生物反應(yīng)器則以其結(jié)構(gòu)簡單、剪切力小、營養(yǎng)物質(zhì)混合均勻、氧氣供應(yīng)充足而在根霉菌固定化發(fā)酵中顯示出極大的優(yōu)越性，據(jù)不完全統(tǒng)計，近70%的研究者都選用這種型式。但是該方式剪切力小、養(yǎng)料供應(yīng)充足易造成固定化菌絲及游離菌絲的過度生長，以至充滿整個發(fā)酵罐而使操作被迫停止；轉(zhuǎn)盤式生物反應(yīng)器已廣泛應(yīng)用于污水處理中，是生物膜法處理污水的重要裝置之一。該固定化方法的特點是能使固定化菌體間歇的在空氣和培養(yǎng)基之間轉(zhuǎn)換。這種固定化的生物被膜可以重復(fù)利用兩周以上而沒有活力損失［16］，但該反應(yīng)器在大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用中有限制；攪拌罐因其攪拌漿產(chǎn)生的剪切力過大而使固定化菌絲易脫落，且游離菌絲易纏繞到攪拌漿上造成攪拌阻力增大，故不易適用于根霉菌的固定化發(fā)酵。但攪拌式發(fā)酵罐是目前生物發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)最常用的反應(yīng)器，少數(shù)研究者也在研究改進固定化材料的機械強度以及攪拌罐的結(jié)構(gòu)，使其在霉菌固定化中使用。近年來，根霉菌自固定化技術(shù)不斷取得突破，使得根霉菌利用攪拌式發(fā)酵罐生產(chǎn)有機酸成為可能，F(xiàn)u等［17］在攪拌式發(fā)酵罐中研究了雙階段溶氧策略調(diào)控米根霉菌球發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸，富馬酸轉(zhuǎn)化率達到了54.2%。有理由相信，結(jié)合自固定化根霉菌在攪拌式發(fā)酵罐中工業(yè)化生產(chǎn)有機酸具有巨大的潛力。

2.3 分離技術(shù)研究

分離過程在生物化學工程中的重要性無論是技術(shù)上，還是經(jīng)濟上都要大大高于傳統(tǒng)的化學工程。因此，發(fā)展和改進生物分離過程本身對整個生物化學工程的發(fā)展占有舉足輕重的地位。而生物分離過程只有有效地與生物反應(yīng)過程相配合、相協(xié)調(diào)，才能充分體現(xiàn)出其特色與先進性。目前在生物反應(yīng)與分離耦合過程中常用的分離方法有：1）基于產(chǎn)物揮發(fā)性的方法；2）萃取法；3）膜分離法；4）固態(tài)化產(chǎn)物分離法。在乳酸、富馬酸發(fā)酵與分離耦合過程中，由于這兩種有機酸沸點較高且高溫下易分解，因而不宜采用基于產(chǎn)物揮發(fā)性的方法，可應(yīng)用的方法主要有：有機溶劑萃取法、膜分離法以及離子交換法。

有機溶劑萃取法是提取化工產(chǎn)品的重要方法，但是該方法存在著產(chǎn)物選擇性差、對菌體有毒害等弊端，因此該技術(shù)的研究還主要集中于發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物的提取，目前萃取有機酸所選用的萃取劑主要包括Alamine 336、Amberlite LA-2、三丙胺（TPO）+TOA，三辛胺（TOA）等。膜分離法是一門新興的跨學科技術(shù)，有機酸提取工藝中研究較多的是電滲析法分離。然而，電滲析法提取有機酸存在膜易污染、生產(chǎn)成本高等問題，因此，以后的研究重心應(yīng)放在降低儀器成本以及耦合體系如何高效耦合等問題上。離子交換樹脂具有吸附容量大，吸附選擇性強，易于工業(yè)化等特點，因此，在有機酸提取中倍受青睞。利用離子交換樹脂對有機酸進行分離純化的工藝已較為成熟，并已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化的應(yīng)用。進入二十世紀九十年代，針對有機酸反應(yīng)分離耦合體系的離子交換分離工藝的研究也越來越引起人們的興趣。如Fu等［18］以根霉菌反應(yīng)分離耦合生產(chǎn)富馬酸體系為研究對象，考察了樹脂Amberlite IRA-400對富馬酸的動態(tài)吸附，并得到了最優(yōu)的吸附條件；同時考慮到發(fā)酵過程中葡萄糖對有機酸吸附的影響，付永前等［17］進一步深入研究了從葡萄糖-富馬酸溶液中提取富馬酸的離子交換工藝，并從6款堿性離子交換樹脂篩選了一款樹脂Amberlite IRA-400，最大吸附量為122mg/g，對葡萄糖吸附較少，利用該樹脂參與富馬酸的發(fā)酵，可以連續(xù)將發(fā)酵液中的富馬酸分離出來，從而維持發(fā)酵所需的pH值，而葡萄糖則返回發(fā)酵罐繼續(xù)參與發(fā)酵，從而能實現(xiàn)富馬酸的連續(xù)發(fā)酵。

2.4 根霉菌反應(yīng)分離耦合生產(chǎn)有機酸耦合工藝的研究

根霉菌反應(yīng)分離耦合生產(chǎn)有機酸工藝就是將以上三個關(guān)鍵技術(shù)進行集成與優(yōu)化。對現(xiàn)有耦合工藝進行總結(jié)發(fā)現(xiàn)，目前，耦合過程中根霉菌的固定化還主要采用載體固定化技術(shù)，反應(yīng)器也多集中于膜轉(zhuǎn)盤式反應(yīng)器，分離技術(shù)采用了有機溶劑萃取、電滲析與離子交換技術(shù)。雖然該工藝路線報導較少，但利用該工藝生產(chǎn)有機酸，有機酸的生產(chǎn)強度顯著提高。

3 小結(jié)與展望

近二十年來，利用根霉菌合成L-乳酸和富馬酸的研究已經(jīng)取得了較大的進展，乳酸以及富馬酸的發(fā)酵水平成倍增長，但進入二十一世紀以來，有機酸的生產(chǎn)卻面臨著發(fā)酵水平有限，生產(chǎn)成本高；存在環(huán)境污染，同時物耗、能耗較大兩大瓶頸問題。綜合耦合體系中各個技術(shù)的研究現(xiàn)狀，筆者建議今后耦合體系應(yīng)從以下幾個方面入手進一步開展研究工作，以解決耦合工藝中存在的問題，實現(xiàn)根霉菌發(fā)酵分離耦合生產(chǎn)有機酸的工業(yè)化生產(chǎn)：1）適于耦合體系根霉菌自固定化技術(shù)的研究；2）適于耦合體系的生物反應(yīng)器的研究；3）適于耦合體系的分離工藝的研究；4）耦合體系集成的研究。

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