靶向抑制G蛋白偶聯(lián)受體激酶2在心力衰竭基因治療中的研究進(jìn)展

宋衍秋 毛用敏

靶向抑制G蛋白偶聯(lián)受體激酶2在心力衰竭基因治療中的研究進(jìn)展

宋衍秋 毛用敏△

G蛋白偶聯(lián)受體激酶2 心力衰竭 受體,腎上腺素能β 基因療法 綜述

心力衰竭是許多器質(zhì)性心臟疾病發(fā)展的終末階段，其發(fā)病機(jī)制及病理生理過程復(fù)雜。傳統(tǒng)的藥物治療雖然能有效緩解心力衰竭的癥狀，降低患者住院率，但其5年病死率仍超過50%[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及對(duì)心血管疾病發(fā)病機(jī)理認(rèn)識(shí)的逐漸深入，基因治療為心力衰竭提供了一種新的治療途徑。

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptors,GPCRs）是一類具有7個(gè)跨膜區(qū)蛋白的超家族。βAR是其之一，其可調(diào)節(jié)心臟對(duì)兒茶酚胺類物質(zhì)的反應(yīng)。βAR信號(hào)在一些心血管疾病中均下降。在心力衰蝎的進(jìn)展過程中，βAR的密度和反應(yīng)性嚴(yán)重降低，這個(gè)過程受G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein coupled receptor kinases,GRKs)的調(diào)節(jié)。慢性心力衰竭心肌細(xì)胞的GRK2也稱為β腎上腺素受體激酶1（β-adrenergic re?ceptor inases 1,βARK1），其活性及表達(dá)水平顯著升高，導(dǎo)致βAR通路減敏及心臟功能降低。目前，有研究發(fā)現(xiàn)通過基因治療調(diào)控GRK2活性可對(duì)多種心臟疾病起到良好的治療作用，為心血管疾病的治療開辟了新途徑[2]。本文將GRK2在正常心臟及心力衰竭中的作用機(jī)制及其在心力衰竭基因治療研究中的新進(jìn)展綜述如下。

1 βARs-G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心臟功能中的作用

目前已發(fā)現(xiàn)的GPCRs有300余種。兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)腎上腺素和去甲腎上腺素與心臟組織βAR相結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)心率、心肌細(xì)胞的收縮、分化、增殖和凋亡等作用[3]。人心肌細(xì)胞βAR有3個(gè)亞型：β1AR、β2AR和β3AR，其中β1AR為優(yōu)勢(shì)型βAR，占總βAR的70%~80%；β2AR次之，約占20%；β3AR呈少量分布[4]。兒茶酚胺類βAR激動(dòng)劑與βAR結(jié)合后，βAR構(gòu)型改變，使與其偶聯(lián)的無(wú)活性GDP-GαGβγ中的Gα與GDP解離，Gα隨繼與GTP結(jié)合成Gα-GTP成為激活狀態(tài)，并與Gβγ亞基分離，繼而激活細(xì)胞膜內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶（AC），AC催化ATP生成環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP），cAMP作為細(xì)胞內(nèi)第二信使激活蛋白激酶A（protein kinase A,PKA），PKA可使多種調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，從而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的正性變時(shí)、變力和變傳導(dǎo)效應(yīng)[5]。Gβγ也可以激活一些下調(diào)效應(yīng)分子，在心臟信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。

在心力衰竭的發(fā)展過程中，βAR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生著微妙的變化，主要表現(xiàn)為β1AR密度的下調(diào)和G蛋白-βAR的失偶聯(lián)（脫敏）[3]。心力衰竭發(fā)生初期，交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增加，心率加快，心肌收縮力增強(qiáng)，使心排血量在相當(dāng)時(shí)間內(nèi)維持正常；然而交感神經(jīng)系統(tǒng)活性長(zhǎng)期增強(qiáng)，可產(chǎn)生兒茶酚胺毒性效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度兒茶酚胺可導(dǎo)致GRK2數(shù)量或活性的改變，從而造成βAR密度下調(diào)和脫敏的發(fā)生，推測(cè)GRK2在心力衰竭的過程中發(fā)揮重要的作用[6]。

2GKR2的生物學(xué)功能

GRKs屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，目前已知的哺乳動(dòng)物有7種GRKs，命名為GRK1~7，其中GRK2在βAR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要的作用。GRK2是位于細(xì)胞膜上的細(xì)胞溶質(zhì)酶，與活化G蛋白的Gβγ亞單位結(jié)合而激活，使活化的βAR跨膜內(nèi)側(cè)的羧基端磷酸化，介導(dǎo)β抑制蛋白與βAR結(jié)合，致使βAR與G蛋白解偶聯(lián)，阻斷βARs-G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致βAR受體密度的降低和脫敏[7]。

心臟βAR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其脫敏處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，以維持正常的心功能。在心力衰竭早期，GRK2的上調(diào)可以抵消交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮所致的兒茶酚胺毒性效應(yīng)，此時(shí)GRK2的上調(diào)可能是心臟的一個(gè)保護(hù)機(jī)制。然而有研究顯示，GRK2過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，βAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，心肌收縮力減弱，呈現(xiàn)慢性心力衰竭的病理生理表現(xiàn)[7]。應(yīng)用GRK2抑制劑—βARKct或者對(duì)小鼠實(shí)行GRK2基因敲除均可顯著增加心肌收縮力及心肌纖維對(duì)兒茶酚胺等神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)性。βARKct同樣可以使轉(zhuǎn)基因過表達(dá)GRK2小鼠心功能及βAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)得以改善[8]。可見，在心力衰竭的發(fā)展進(jìn)程中，GRK2的過度表達(dá)已并非心臟的保護(hù)機(jī)制，很可能是促進(jìn)心力衰竭進(jìn)展的一個(gè)重要因素。

3 靶向抑制GRK2在心力衰竭基因治療中的新進(jìn)展

20世紀(jì)90年代以來(lái)，針對(duì)βAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑展開的基因治療一直是心力衰竭的研究熱點(diǎn)。Drazner等[9]利用腺病毒載體構(gòu)建了攜帶GRK2抑制劑—βARKct的重組腺病毒Ad-βARKct，感染成年兔左室肌細(xì)胞，可顯著改善心肌細(xì)胞βAR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Williams等[10]發(fā)現(xiàn)Ad-βARKct體外感染人心力衰竭心肌細(xì)胞，可使心肌細(xì)胞收縮力及βAR反應(yīng)性均增強(qiáng)，為干預(yù)GRK2活性的基因治療應(yīng)用于人心力衰竭的治療提供了可行性依據(jù)。此后，抑制GRK2基因治療的在體實(shí)驗(yàn)得以開展。White等[11]首次利用腺病毒載體將βARKct經(jīng)冠脈導(dǎo)入心肌梗死兔體內(nèi)，3周后，實(shí)驗(yàn)兔心臟收縮功能改善，βAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能得以恢復(fù)，并且能夠預(yù)防左心室重構(gòu)。該研究首次證實(shí)了βARKct在心力衰竭活體模型中的治療作用。Shah等[12]制備兔心肌梗死后心力衰竭模型，經(jīng)導(dǎo)管冠脈給予Ad-βARKct，1周后發(fā)現(xiàn)βARKct在心臟組織得到有效表達(dá)，左室收縮末壓降低，左心功能增強(qiáng)，βAR脫敏現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)。βARKct同樣可以改善肺動(dòng)脈高壓致右心衰兔模型右心室功能，并降低動(dòng)物致死率[13]。此外，Tevaearai等[14]也證實(shí)了βARKct對(duì)于急性缺血性心肌損傷的治療作用，使左室心功能及βAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能得以改善。上述研究提示，GRK2的靶向抑制對(duì)心力衰竭的治療可能具有重要的作用。

雖然腺病毒載體具有低毒、高效、大容量等諸多優(yōu)點(diǎn)，但由于其在體內(nèi)表達(dá)時(shí)間相對(duì)較短，只能對(duì)GRK2的靶向抑制治療作用短期觀察，特別限制了其在慢性心力衰竭方面的研究。Rengo等[15]利用腺相關(guān)病毒載體在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建重組6型腺相關(guān)病毒AAV6-βARKct，并觀察其對(duì)慢性心力衰竭大鼠的治療作用，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)冷凍左室游離壁12周后，成功制備了心肌梗死后慢性心力衰竭模型。直接局部心肌注射AAV6-βARKct基因治療12周后，發(fā)現(xiàn)βARKct在心肌組織中表達(dá)穩(wěn)定，超聲心動(dòng)圖及血液動(dòng)力學(xué)檢測(cè)表明心功能顯著改善；心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，心肌細(xì)胞膜βAR密度增加，心肌細(xì)胞內(nèi)GRK2水平顯著降低，大鼠心臟指數(shù)顯著降低，心肌組織I型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、A型利鈉肽、B型利鈉肽表達(dá)降低；此外，大鼠血漿腎上腺素、去甲腎上腺素及醛固酮水平也均下降。該研究明確了長(zhǎng)期βARKct治療對(duì)慢性心力衰竭有顯著的治療作用，同時(shí)提示長(zhǎng)時(shí)間抑制GRK2可改善慢性心力衰竭的心室重構(gòu)。

心力衰竭一個(gè)顯著的病理生理學(xué)特征是交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增高，血循環(huán)兒茶酚胺類物質(zhì)濃度升高，而高濃度兒茶酚胺類物質(zhì)又可引起心臟毒性效應(yīng)，在心力衰竭的發(fā)展過程中具有重要作用，機(jī)體血循環(huán)兒茶酚胺類物質(zhì)主要由交感神經(jīng)系統(tǒng)末梢和腎上腺髓質(zhì)分泌[16]。研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腎上腺髓質(zhì)過度表達(dá)GRK2，可導(dǎo)致兒茶酚胺類物質(zhì)濃度緩慢升高[17]。Ad-βARKct特異性感染大鼠腎上腺髓質(zhì)，降低GRK2表達(dá)后，血清兒茶酚胺類物質(zhì)顯著降低[18]。Ad-βARKct特異性感染心肌梗死后心力衰竭大鼠腎上腺髓質(zhì)，降低腎上腺髓質(zhì)GRK2表達(dá)水平，可以顯著降低大鼠體內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)水平，大鼠心功能改善[19]。特異敲除腎上腺嗜鉻細(xì)胞GRK2基因小鼠，心梗后4周血清腎上腺素和去甲腎上腺素水平均降低，心功能提高，心臟βAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改善[20]。此外，研究發(fā)現(xiàn)腎上腺GRK2與位于腎上腺皮質(zhì)的作用因子β抑制蛋白-1相互作用，影響腎上腺皮質(zhì)激素醛固酮的分泌；心肌梗死后心力衰竭大鼠腎上腺GRK2過度表達(dá)，血清醛固酮水平增加，而醛固酮在慢性心力衰竭的進(jìn)展過程中也具有重要作用[21]。上述實(shí)驗(yàn)表明，腎上腺靶向抑制GRK2，可降低交感神經(jīng)系統(tǒng)活性及醛固酮的分泌，可能成為預(yù)防和治療心力衰竭的一個(gè)新靶點(diǎn)。

目前基因治療的發(fā)展仍然面臨著一些亟待解決的問題，如載體的安全性、轉(zhuǎn)染效率及目的基因表達(dá)等。但隨著對(duì)GRK2研究的逐漸深入，以抑制其活性為靶點(diǎn)的基因治療，仍具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，可能成為預(yù)防并治療心力衰竭的一個(gè)全新途徑。

[1]Braunwald E,Bristow MR.Congestive heart failure:fifty years of progress[J].Circulation,2000,102(20 Suppl4):IV14-23.

[2]Jessup M,Greenberg B,Mancini D,et al.Calcium Upregulation by Percutaneous Administration of Gene Therapy in Cardiac Disease(CUPID):a phase 2 trial of intracoronary gene therapy of sarcoplas?mic reticulum Ca2+-ATPase in patients with advanced heart failure[J].Cireulation,2011,124(3):304-313.

[3]Hamdani N,Linke WA.Alteration of the beta-adrenergic signaling pathway in human heart failure[J].Curr Pharm Biotechnol,2012,Jan 20(Epub ahend of print).

[4]Fu Y,Xiao H,Zhang Y.Beta-adrenoceptor signaling pathways me?diate cardiac pathological remodeling[J].Front Biosci(Elite Ed),2012,4:1625-1637.

[5]Nagatomo Y,Yoshikawa T,Kohno T,et al.A pilot study on the role of autoantibody targeting the beta1-adrenergic receptor in the re?sponse to beta-blocker therapy for congestive heart failure[J].J Card Fail,2009,15(3):224-232.

[6]Rengo G,Lymperopoulos A,Leosco D,et al.GRK2 as a novel gene therapy target in heart failure[J].J Mol Cell Cardiol,2011,50(5):785-792.

[7]Evron T,Daigle TL,Caron MG.GRK2:multiple roles beyond G pro?tein-coupled receptor desensitization[J].Trends Pharmacol Sci,2012,33(3):154-164.

[8]Lymperopoulos A,Rengo G,Koch WJ.GRK2 inhibition in heart failure:something old,something new[J].Curr Pharm Des,2012,18(2):186-191.

[9]Drazner MH,Peppel KC,Dyer S,et al.Potentiation of beta-adrener?gic signaling by adenoviral-mediated gene transfer in adult rabbit ventricular myocytes[J].J Clin Invest,1997,99(2):288-296.

[10]Williams ML,Hata JA,Schroder J,et al.Targeted beta-adrenergic receptor kinase(betaARK1)inhibition by gene transfer in failing human hearts[J].Circulation,2004,109(13):1590-1593.

[11]White DC,Hata JA,Shah AS,et al.Preservation of myocardial be?ta-adrenergic receptor signaling delays the development of heart failure after myocardial infarction[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(10):5428-5433.

[12]Shah AS,White DC,Emani S,et al.In vivo ventricular gene deliv?ery of a beta-adrenergic receptor kinase inhibitor to the failing heart reverses cardiac dysfunction[J].Circulation,2001,103(9):1311-1316.

[13]Emani SM,Shah AS,Bowman MK,et al.Right ventricular targeted gene transfer of a beta-adrenergic receptor kinase inhibitor im?proves ventricular performance after pulmonary artery banding[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2004,127(3):787-793.

[14]Tevaearai HT,Walton GB,Keys JR,et al.Acute ischemic cardiac dysfunction is attenuated via gene transfer of a peptide inhibitor of the beta-adrenergic receptor kinase(betaARK1)[J].J Gene Med,2005,7(9):1172-1177.

[15]Rengo G,Lymperopoulos A,Zincarelli C,et al.Myocardial ade?no-associated virus serotype 6-betaARKct gene therapy improves cardiac function and normalizes the neurohormonal axis in chronic heart failure[J].Circulation,2009,119(1):89-98.

[16]Lymperopoulos A,Rengo G,Koch WJ.Adrenal adrenoceptors in heart failure:fine-tuning cardiac stimulation[J].Trends Mol Med,2007,13(12):503-511.

[17]Rengo G,Leosco D,Zincarelli C.Adrenal GRK2 lowering is an un?derlying mechanism for the beneficial sympathetic effects of exer?cise training in heart failure[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,298(6):H2032-2038.

[18]Lymperopoulos A,Rengo G,Zincarelli C,et al.Modulation of adre?nal catecholamine secretion by in vivo gene transfer and manipula?tion of G protein-coupled receptor kinase-2 activity[J].Mol Ther,2008,16(2):302-307.

[19]Lymperopoulos A,Rengo G,Funakoshi H,et al.Adrenal GRK2 up?regulation mediates sympathetic overdrive in heart failure[J].Nat Med,2007,13(3):315-323.

[20]Lymperopoulos A,Rengo G,Gao E,et al.Reduction of sympathetic activity via adrenal-targeted GRK2 gene deletion attenuates heart failure progression and improves cardiac function after myocardial infarction[J].J Biol Chem,2010,285(21):16378-16386.

[21]Lymperopoulos A,Rengo G,Zincarelli C,et al.Adrenal beta-arres?tin 1 inhibition in vivo attenuates post-myocardial infarction pro?gression to heart failure and adverse remodeling via reduction of cir?culating aldosterone levels[J].J Am Coll Cardiol,2011,57(3):356-365.

300050 天津市胸科醫(yī)院，天津市心血管病研究所△審校者

（2011-10-24收稿 2012-03-06修回）

（本文編輯 閆娟）