JAK2V617F基因突變在骨髓增生性疾病中檢測的臨床意義

劉蘊華 徐征

慢性骨髓增殖性疾病(MPD)是一組以一系或多系髓系細胞增殖為主要特征的克隆性造血干細胞疾病。以慢性粒細胞白血病(CML)、真性紅細胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)及特發(fā)性骨髓纖維化(MF)最常見。病因仍然不十分清楚，除慢性粒細胞性白血病(CML)具有特征性的Ph染色體和BCR/ABL融合基因以外，其余均缺乏特征性分子診斷標志。2005年幾個研究小組［1-3］分別報道，在BCR/ABL陰性骨髓增生性疾病(MPD)患者中存在JAK2基因的點突變-JAK2V617F，這一基因突變的發(fā)現(xiàn)和研究改變了MPD的分類和診斷，WHO 2008年修訂的 MPD診斷標準中已把JAK2V617F突變列為首選檢測項目，有無 JAK2突變成為MPD主要的診斷指標［4］。我們對我院25例MPD患者進行JAK2V617F檢測，并初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月1日至2011年10月30日在本院血液科擬診的骨髓增殖性疾病(MPD)患者25例為研究組，其中男12例，女13例，中位年齡58歲(36～87歲)。經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學、組織化學、骨髓病理、染色體、BCR/ABL融合基因等檢查確診，符合WHO 2008年修訂的MPD診斷標準［4］:真性紅細胞增多癥(PV)13例，原發(fā)性血小板增多癥(ET)12例。15例對照組為缺鐵性貧血繼發(fā)血小板增多5例(補鐵治療后血小板恢復正常)，慢性粒細胞性白血病5例、急性白血病5例包括急性淋巴細胞白血病2例、急性髓系白血病M2a 2例、M4 1例。

1.2 標本采集 抽取患者骨髓2～3 ml或外周血3～5 ml，EDTA抗凝，2℃～8℃冷藏運輸，24 h內(nèi)送廣州金域進行檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 JAK2V617F定性檢測 應用等位基因特異性聚合酶鏈反應(AS-PCR)進行JAK2基因突變定性檢測。從送檢樣本中提取基因組DNA，采取等位基因特異性PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，通過擴增片段大小的不同來判斷基因狀態(tài)。

1.3.2 JAK2 exon12＆13突變檢測 JAK2V617F陰性的患者，加測JAK2 exon12＆13。從送檢樣本中提取基因組DNA，通過特異引物擴增JAK2基因外顯子12＆13，擴增PCR產(chǎn)物采用Sanger測序法進行雙向測序，將測序所得的序列與NCBI參考序列進行對比，分析JAK2基因的基因狀態(tài)。

2 結果

25例MPD患者中JAK2V617F基因突變率為72%，其中真性紅細胞增多癥(PV)患者陽性率為92.3%(12/13)，其中1例JAK2V617F突變陰性患者檢測JAK2 exon12＆13亦為陰性，結合骨髓細胞學和骨髓活檢符合PV，按照PV治療有效。原發(fā)性血小板增多癥(ET)陽性率為50%(6/12)，其中6例JAK2陰性患者檢測JAK2 exon12＆13均為陰性，結合骨髓細胞學及骨髓病理均符合ET，按ET治療有效。5例缺鐵性貧血繼發(fā)血小板增多患者、5例急性白血病和5例慢性髓系白血病患者JAK2V617F均陰性。2例PV患者以腦血栓起病，1例出現(xiàn)心肌梗死，1例PV鼻出血不止。3例ET出現(xiàn)腦血栓，2例ET患者反復上消化道出血伴脾腫大，被誤診為肝硬化并食道胃底靜脈曲張破裂，分別在我院和外院施行了脾切除及噴門周圍血管離斷術，1例ET患者反復出現(xiàn)右臀部血腫。余13例MPD患者未發(fā)生出血/血栓事件。

3 討論

真性紅細胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)和特發(fā)性骨髓纖維化(MF)是臨床上經(jīng)典的慢性骨髓增殖性疾病(MPD)。JAK2V617F突變在PV、ET、MF中發(fā)生率不同，分別為 65%～97%、23%～57% 和 35%～57%［5］。2008年WHO修訂MPD診斷標準也是依據(jù)多數(shù)MPD患者都具有JAK2突變，主要是JAK2V617F，還有極少數(shù)JAK2 exon 12＆13突變。僅檢測JAK2V617F突變不能單獨用來區(qū)別不同類型的MPD，還要結合骨髓細胞學及骨髓組織病理學依據(jù)進行診斷PV、ET、MF，并且要排除反應性紅細胞增多癥、繼發(fā)性血小板增多癥及骨髓纖維化。本組研究亦驗證了JAK2V617F突變對PV診斷意義最大，PV患者幾乎都有突變，僅1例JAK2V617F突變陰性患者，結合骨髓病理依據(jù)符合PV，按PV治療有效。ET中JAK2VV617F突變率為50%，與文獻相吻合［5］。本組研究中，對 JAK2V617F突變陰性的 PV、ET患者加測JAK2 exon 12＆13突變均為陰性，測序法檢測靈敏度為20%左右，不排除存在假陰性的可能。還有可能存在其他基因突變，如MPLW515L/K突變。對照組5例缺鐵性貧血反應性血小板增高、5例急性白血病和5例慢性粒細胞白血病JAK2V617F突變檢測均陰性。本研究表明，JAK2V617F突變MPD發(fā)生率較高，而在急性白血病、慢性粒細胞白血病和其他血液病中未見。這將有助于BCR/ABL陰性的MPD與其他血液病的鑒別診斷。

血栓和出血以及向白血病轉(zhuǎn)化是MPD死亡的主要因素。約有12%～39%的PV和11%～25%的ET以血栓事件起病，1.7%～20%的PV和3.6%～37%的ET以出血起病［6］。本組13例PV患者中3例以血栓事件起病，占23.07%，1例以出血事件起病占7.69%，12例ET患者中3例以血栓起病，3例以出血起病，各占25%，與報道吻合［6］。2例ET患者以反復上消化道出血起病，伴脾大，被誤診為肝硬化并食道胃底靜脈破裂出血，分別在我院或外院進行了脾切除及噴門周圍血管離斷術。脾切除可能使原發(fā)性血小板增多癥患者病情惡化，故屬禁忌［7］。在我院做脾切除手術患者血小板的變化分別為:術前423～456×109/L，術后第3天1275×109/L，術后第7天2625×109/L，術后第8天出院，術后第14天血小板為2740×109/L，并且因上消化道再次出血而急診入住消化科，后經(jīng)會診轉(zhuǎn)入血液科，經(jīng)過骨髓細胞形態(tài)學、骨髓組織病理學、BCR/ABL融合基因及JAK2V617F突變檢測，確診為ET，應用羥基脲治療有效。

國內(nèi)診斷標準［8］PV(B法):血紅蛋白 男＞200 g/L，女＞190 g/L，ET:血小板 ＞1000×109/L，作為診斷標準有些過高，使得MPD患者確診過晚，血栓/出血事件發(fā)生風險增加。因此，血紅蛋白男性＞185 g/L、女性＞165 g/L，或 血小板＞450×109/L，且漸進性升高者，把JAK2V617F突變作為PV、ET的重要檢測項目及主要診斷指標，有助于提高MPD患者早期診斷率，降低誤診率。

綜上所述，JAK2V617F基因突變檢測有助于BCR/AB L陰性的MPD的診斷，使MPD能夠早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，預防和減少血栓或出血事件發(fā)生。值得臨床推廣應用。

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