博爾納病毒的研究進(jìn)展

金興振（綜述），徐 平（審校）

博爾納病病毒（Borna disease virus，BDV）最早發(fā)現(xiàn)是在18世紀(jì)末德國(guó)的南部出現(xiàn)了少量的散發(fā)感染病例，但是在當(dāng)時(shí)還沒有對(duì)它正式的命名。1894－1896年在Saxony州Borna鎮(zhèn)的馬群中曾經(jīng)暴發(fā)流行一種腦炎，當(dāng)時(shí)德國(guó)正處于威廉二世皇帝統(tǒng)治的時(shí)期，積極地準(zhǔn)備對(duì)外擴(kuò)張，出現(xiàn)這一事件必然引起了他們的高度重視，博爾納?。˙orna disease，BD）因此而得名并首次為人們所認(rèn)識(shí)［1］。

直到20世紀(jì)初，Zwick最早在被病毒感染的馬腦組織中分離鑒定了BDV病毒株，之后Bode在精神疾病患者外周血淋巴細(xì)胞中分離了BDV的V株，其后世界各地在患病動(dòng)物和臨床患者中不斷分離到BDV的病毒株［2］。最初認(rèn)為BDV感染只是分布在德國(guó)南部、瑞士、奧地利以及列支敦士頓等萊茵河上游地區(qū)的散發(fā)感染［3］。但是后來在另外的7個(gè)國(guó)家，包括人類在內(nèi)的大多數(shù)恒溫動(dòng)物中分離或者檢測(cè)出病毒，人們才逐漸意識(shí)到BDV有著更為廣闊的感染區(qū)域。

BDV是一種非節(jié)段性的單股負(fù)鏈RNA病毒（Nonsegmented negative－strand RNA virus，NNR病毒），為單股負(fù)鏈病毒目中的一個(gè)新的家族Borna病毒科的典型代表［4］。BDV具有嚴(yán)格嗜神經(jīng)性，并可長(zhǎng)期寄居在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)而不被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，明確其致病機(jī)制對(duì)許多神經(jīng)系統(tǒng)的疾病及病毒持續(xù)感染的研究具有重要意義［5］。BDV基因組長(zhǎng)8．9kb，具有6個(gè)可讀框，分別編碼磷蛋白（Phosphoprotein，P）、核蛋白（Nucleoprotein，N）、糖蛋白（Glycoprotein，G）、基質(zhì)蛋白（Matrix protein，M）、X蛋白（X）和RNA依賴的 RNA 聚合酶（L）。BDV在分子生物學(xué)方面有幾個(gè)特征：（1）定位于核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制；（2）重疊的可讀框與轉(zhuǎn)錄單位；（3）亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄后的修飾；（4）在不同動(dòng)物種屬和組織培養(yǎng)系統(tǒng)中編碼序列的顯著保守性。

1 BDV流行病學(xué)調(diào)查

BDV是一種高度嗜神經(jīng)病毒。原本是存在于德國(guó)東南部的馬和羊體內(nèi)的一種自然病原體，但是從目前掌握的資料來看，它已經(jīng)感染了許多物種，從鳥類到世界各地的靈長(zhǎng)類動(dòng)物［6］，不僅可以引起馬、羊等家畜的自然感染，還可以引起嚙齒類動(dòng)物感染，甚至是除人以外的靈長(zhǎng)類動(dòng)物均易受到BDV的感染。馬和羊是BDV主要的感染動(dòng)物，已經(jīng)認(rèn)定為主要的自然宿主，國(guó)內(nèi)外多篇報(bào)道均有充分證實(shí)，馬的BDV特異性抗體在各大洲也得到證實(shí)。此外，國(guó)外還報(bào)道了BD自然病例零星發(fā)生于如除山羊以外的其他家養(yǎng)動(dòng)物，例如Hodgson等人發(fā)現(xiàn)澳大利亞貓的自然感染證據(jù)［7］。不僅是家養(yǎng)動(dòng)物有自然感染的報(bào)告，野外生存動(dòng)物感染病例也有報(bào)道，日本科學(xué)家通過對(duì)野外生存的浣熊采用RT－PCR的方法研究，得出結(jié)論：一個(gè)遺傳度很高的BDV序列來源于浣熊的血清［8］。除此之外，BD還在羊駝身上首次得到確診［9］。自然感染的雙色白齒鼩組織中BDV抗原的RNA的分布也支持它們作為宿主物種［10］。野生的鳥類也可能作為亞臨床感染的攜帶者，這或許可以解釋在某些年份，與其他疾病相比，有些疾病的季節(jié)性（春季和夏初）發(fā)病率較高的原因。但是確切的流行病學(xué)證據(jù)還沒有完全掌握［11］。

盡管針對(duì)動(dòng)物的報(bào)道不斷更新，但是目前的數(shù)據(jù)顯示，BDV在人類神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制一直沒有明確，是否存在持續(xù)感染或者機(jī)體清除病毒感染也同樣沒有定論。有些研究證實(shí)，在某些精神疾病病人的血清中存在BDV特異性抗體，但是同樣也有些大樣本的研究卻沒有發(fā)現(xiàn)抗體和病毒存在的證據(jù)。例如，Heinrich A等人通過對(duì)94例精神病患者長(zhǎng)達(dá)20年的BDV特異性抗體滴度檢測(cè)并聯(lián)系臨床情況分析得出，人類存在慢性BDV感染［12］，而Na K S等檢測(cè)了198例患有精神疾病的病人血樣，均未檢到BDV或抗體［13］。另外，一項(xiàng)捷克共和國(guó)的前瞻性研究對(duì)酒精和藥物依賴病人以及健康獻(xiàn)血者的血清循環(huán)免疫復(fù)合物進(jìn)行分析表明：沒有發(fā)現(xiàn)成癮患者較正常對(duì)照組有明顯增高的BDV循環(huán)免疫復(fù)合物水平，高水平的BDV免疫復(fù)合物在低水平γ—谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和低年齡的患者中被檢測(cè)到［14］。

在最近的研究中，不斷地有報(bào)道在神經(jīng)精神疾病如精神分裂癥、自閉癥、慢性疲勞綜合征和慢性抑郁癥患者中檢測(cè)到BDV，日本和美國(guó)科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，人類和其他哺乳動(dòng)物的一部分DNA最早來自于一種RNA病毒——博爾納病毒（Borna virus）。研究人員認(rèn)為，這種來源于病毒的DNA可能是引起基因突變的原因之一，也可能導(dǎo)致如精神分裂癥之類的精神疾病。病毒序列同化到宿主細(xì)胞基因組中的過程稱為內(nèi)生化（endogenization）。當(dāng)這種病毒的DNA整合到生殖細(xì)胞的染色體，將會(huì)隨生殖細(xì)胞傳遞到子代個(gè)體中。此前逆轉(zhuǎn)錄病毒是唯一已知的可在脊椎動(dòng)物中內(nèi)生化的病毒。但最新的這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，非逆轉(zhuǎn)錄病毒博爾納病毒也可在進(jìn)化過程中內(nèi)生化到哺乳動(dòng)物基因組中［15］。有相關(guān)評(píng)論也明確指出，BDV在哺乳類動(dòng)物的基因組，包括人類基因組、非人類靈長(zhǎng)類基因組、嚙齒類動(dòng)物基因組和大象基因組中存在有DNA片段序列，并可遺傳給后代［16］。進(jìn)一步提示BDV與人類疾病的發(fā)病關(guān)系密切。

2 BDV的檢測(cè)方法

2．1 實(shí)時(shí)熒光定PCR是一種新近發(fā)展出的技術(shù)，該技術(shù)使用一個(gè)雙標(biāo)記的TaqMan熒光探針，能實(shí)時(shí)檢測(cè)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR技術(shù)在敏感性和特異性方面具有以下特點(diǎn)［17］：（1）當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到檢測(cè)點(diǎn) Ct值時(shí)，PCR 反應(yīng)體系處于最佳飽和狀態(tài)，最能反映起始的模板數(shù)，克服了常規(guī)PCR平臺(tái)效應(yīng)帶來的誤差。因此，可準(zhǔn)確定量待檢模板的拷貝數(shù)；（2）閉管檢測(cè)，不需PCR產(chǎn)物后處理，有效避免了擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染引起的假陽(yáng)性；（3）引物和探針特異地同目的模板結(jié)合，相當(dāng)于PCR技術(shù)與寡核苷酸探針雜交技術(shù)二者之結(jié)合，保障了檢測(cè)的特異性。但并沒有在PCR之后單獨(dú)做雜交的操作，而是貫穿于整個(gè)PCR過程中同時(shí)完成的；（4）熒光檢測(cè)的靈敏度顯著高于肉眼觀察電泳條帶的靈敏度；（5）操作簡(jiǎn)單、方便、安全、快速，整個(gè)過程由電腦控制，不存在溴化乙錠和同位素對(duì)人體的危害性問題。目前反轉(zhuǎn)錄后熒光定量PCR已經(jīng)取代常規(guī)PCR來檢測(cè)定量血液或組織樣本中的BDV RNA，在不同的患病人群中，檢測(cè)陽(yáng)性率各不相同。成為診斷BDV感染的一種重要方法。

何豐等［18］在牧羊犬外周血和腦組織博爾納病病毒檢測(cè)結(jié)果的比較研究中使用FQ－nRT－PCR對(duì)標(biāo)本RNA進(jìn)行BDV p24基因片段檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100只牧羊犬中，其中有9例腦組織標(biāo)本是陽(yáng)性，而同時(shí)對(duì)應(yīng)的只有5例外周血標(biāo)本呈陽(yáng)性。其余所有牧羊犬的腦組織和外周血標(biāo)本都為陰性。陽(yáng)性率分別為9%，5%。

劉建等［19］在博爾納病毒在寧夏的人和動(dòng)物感染的檢測(cè)中研究采用巢式逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法在60例VE的患者中BDV P24陽(yáng)性患者3例，陽(yáng)性檢出率為5%，其中7例患者BDV P40 PCR電泳后與P40標(biāo)準(zhǔn)品相同，片段大小在154bp左右，陽(yáng)性檢出率5．88%；在VE患者接觸的動(dòng)物檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)109頭綿羊P24呈陽(yáng)性曲線，陽(yáng)性率15．35%，P40電泳后發(fā)現(xiàn)9頭綿羊陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為1．27%。

趙莉等［20］在寧夏綿羊腦組織博爾納病病毒的自然感染狀況的研究中應(yīng)用FQ－nRT－PCR檢測(cè)了寧夏163只綿羊腦組織中的BDV p24基因片段，其陽(yáng)性率為3．68% （6／163），6例陽(yáng)性標(biāo)本同時(shí)都檢測(cè)到了p40基因片段，說明在綿羊顳葉腦組織中既可檢測(cè)到p24基因片段又可檢測(cè)到p40基因片段。2．2 免疫印跡法是將病毒的抗原通過電泳分離后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，與待測(cè)樣本的血清（一抗）結(jié)合后用標(biāo)記的抗宿主抗體（二抗）顯色。使用BDV單克隆抗體作為Marker，可以鑒定不同分子量的抗原蛋白。同時(shí)使用未感染和已經(jīng)感染的樣本作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。另外免疫印跡還有費(fèi)時(shí)、昂貴和敏感性與特異性呈反比等特點(diǎn)［21］。

2．3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法和免疫熒光不同，其結(jié)果的評(píng)判多采用機(jī)器，故較為客觀。該方法血清學(xué)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性并不一定代表被檢者正存在BDV感染，因?yàn)槟壳暗难芯砍晒胁磺宄﨎DV抗體陽(yáng)性是代表BDV感染存在還是BDV已被清除。但是采用三聯(lián)－ELISA法檢測(cè)BDV病毒抗原，使用相同特異BDV參數(shù)，可以識(shí)別天然抗體，抗原，免疫復(fù)合物。具有穩(wěn)定﹑可信﹑敏感的優(yōu)點(diǎn)，是唯一檢測(cè)感染活化的方法，并可監(jiān)控治療效果的指標(biāo)。

另外，蛋白免疫印跡方法的確可以確診許多病毒感染，并且適用于分辨血清中和腦脊液中抗蛋白N和P的抗體。然而，蛋白免疫印跡并不是診斷人類BDV的前沿方法，因?yàn)樗鄬?duì)于新一代的用病毒本身的抗體來檢測(cè)的ELISAS來講敏感度太低。最近BDV N，P蛋白的抗原決定簇映射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明與檢測(cè)病毒自身抗體的ELISA結(jié)果一致，并且該結(jié)果支持本身的抗原決定簇的構(gòu)象是有效識(shí)別抗BDV抗體的關(guān)鍵。

Liv Bode和Hans Ludwig［22］以及他們的實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)的ELISA是基于一種抗體穩(wěn)定的雙層三明治結(jié)構(gòu)單克隆抗體以用來識(shí)別BDV蛋白N（P40）和蛋白P（P24）的抗原決定簇構(gòu)象—BDV感染中主要起免疫作用的組分。結(jié)合在自身BDV抗體上的單克隆抗體由非純化感染的馬的大腦或者持續(xù)感染的組織的培養(yǎng)細(xì)胞制備而來。目前，之所以選擇該方法是因?yàn)樗哂休^高的敏感度和特異性，并且它將成為檢測(cè)該類抗體的金標(biāo)準(zhǔn)。

2．4 病毒分離被公認(rèn)是檢測(cè)病毒的金指標(biāo)。該方法通常由組織勻漿培養(yǎng)和活體動(dòng)物培養(yǎng)兩部分組成。依據(jù)原始的BDV的濃度，其勻漿培養(yǎng)的陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)時(shí)間從24h到幾個(gè)月不等。病毒感染最常使用的和最敏感的細(xì)胞是Vero細(xì)胞、C6細(xì)胞和MDCK細(xì)胞，持續(xù)的細(xì)胞感染過程中沒有細(xì)胞病變發(fā)生?；铙w培養(yǎng)最為常用的動(dòng)物是兔和小鼠。由于BDV感染時(shí)病毒量很少，所以使用傳統(tǒng)的病毒分離方法不僅復(fù)雜而且敏感性很低［21］。

Sakudo A等［23］改進(jìn)病毒分離方法，使用陰離子聚合物涂層磁珠，來分離博爾納病病毒，并通過PCR和WB確認(rèn)獲得成功，這種方法雖然操作復(fù)雜，但是可能會(huì)提高BDV的檢出率。

2．5 其他檢測(cè)方法 截止目前的研究資料，還沒有足夠的證據(jù)證明BDV是人類疾病的致病因素，最近對(duì)BDV抗體的研究也只是提示感染的標(biāo)準(zhǔn)物，這些抗體的發(fā)現(xiàn)不僅是在神經(jīng)精神疾病，也存在于免疫功能低下的健康個(gè)人，因此確定新的特異性感染標(biāo)志物來解釋這個(gè)問題顯得尤為重要，對(duì)于人感染BDV的診斷以及對(duì)它發(fā)病機(jī)制的了解來說，在感染過程中表達(dá)的蛋白質(zhì)的檢測(cè)已經(jīng)成為研究的關(guān)鍵領(lǐng)域，隨著技術(shù)的不斷更新，在神經(jīng)精神疾病患者外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)BDV抗原抗體和核酸的新方法已經(jīng)開始應(yīng)用。這些技術(shù)包括血液中的病毒特異性抗體的檢測(cè)，循環(huán)免疫復(fù)合物和循環(huán)血漿抗原以及T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)等等。

德國(guó)科學(xué)家Heinrich A等［12］在1985－2006年期間對(duì)精神分裂癥患者（n＝46）、情感障礙患者（n＝19）、其他精神疾病患者（n＝29）共94例血清陽(yáng)性病人采用間接免疫熒光法反復(fù)監(jiān)測(cè)BDV特異性抗體滴度和臨床情況。該小組對(duì)46例患者進(jìn)行了大于36個(gè)月的長(zhǎng)期抗體滴度分析，并測(cè)定博爾納病毒特異性抗體長(zhǎng)期滴度動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示有25例病人血清呈持續(xù)陽(yáng)性反映54．3%（25／46）。對(duì)精神病患者群體持續(xù)陽(yáng)性血清的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)分析，表明人類存在BDV慢性感染的可能。

捷克學(xué)者Rackova S［24］對(duì)39例在精神科住院的病人進(jìn)行BDV血漿免疫復(fù)合物的檢測(cè)，結(jié)果顯示在第0d、28d、56d精神疾病患者的BDV－CIC檢出率 分 別 為 66．7% （26／39）；53．9% （14／26）；52．9%（9／17）。健康對(duì)照組為22．2% （28／126）。這一結(jié)果說明了BDV－CIC在精神病人的檢出率比健康人高（P＝0．001）。而且病情越重的精神疾病患者的BDV－CIC的檢出率越高，提示BDV在體內(nèi)的復(fù)制數(shù)量和侵襲程度可能與精神疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。捷克共和國(guó)另外一項(xiàng)針對(duì)成癮性病人陽(yáng)性BDV－CIC的前瞻性研究［14］，采用ELISA方法檢測(cè)了酒精和藥物依賴病人以及健康獻(xiàn)血者的血清CIC。結(jié)果顯示：陽(yáng)性BDV－CIC在開始時(shí)陽(yáng)性率為36．5%，8w后陽(yáng)性率達(dá)到42．86%，對(duì)照組的陽(yáng)性率為37．3%，沒有發(fā)現(xiàn)成癮性患者比健康獻(xiàn)血者有更高的 BDV－CIC陽(yáng)性率（P＝0．179），高水平的BDV－CIC可能與低水平GGT以及低年齡有關(guān)。

3 BDV的治療

目前尚未制定對(duì)BD患者具體的治療方法，但是少數(shù)的藥物常被用來進(jìn)行治療，例如金剛烷胺，就是其中之一，它是一種非競(jìng)爭(zhēng)性的N－甲基－D型（N－methyl－D－aspirate type）谷氨酸受體拮抗劑，也具備結(jié)合活性煙堿乙酰膽堿受體的能力［25］。其機(jī)制可能是通過增加合成和釋放多巴胺以及減少神經(jīng)元攝取來起作用。它也被認(rèn)為有一定的抗病毒作用，可以干擾宿主細(xì)胞病毒基因組的脫殼和釋放。所以，它不僅可以抑制BDV成熟細(xì)胞在體外的復(fù)制還可以防止幼稚細(xì)胞的復(fù)制。一項(xiàng)針對(duì)急性抑郁癥或者雙相情感障礙患者的臨床實(shí)驗(yàn)證明，金剛烷胺的治療效果顯著，5年的隨訪顯示血漿抗原水平不斷降低［22］。

在動(dòng)物的預(yù)防和控制方面，三環(huán)癸胺硫酸鹽，一種抗A型流感病毒活性的藥物，被推薦用于BD病馬的治療。然而，它在BDV感染細(xì)胞和感染動(dòng)物的治療上具有不同的效果。例如Rubin SA等［27］用α－4結(jié)合素單克隆抗體治療動(dòng)物BD，結(jié)果在慢性漸近性BD病例中獲得了顯著的臨床效果，CNS中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少。

4 BDV的展望

BDV是一種無(wú)論從基因角度還是從生物學(xué)來講相對(duì)獨(dú)立的病毒，不但能夠感染馬，羊，狗等各種溫血?jiǎng)游铮谏窠?jīng)精神疾病患者的血液和腦脊液檢查中均發(fā)現(xiàn)BDV感染的證據(jù)，說明了BDV也存在感染人類的潛在威脅。盡管BDV在人群中感染和與人類疾病關(guān)系密切已經(jīng)廣泛報(bào)道，但是諸如血清學(xué)檢查在實(shí)驗(yàn)室間的差異、抗體檢測(cè)滴度較低等都需要進(jìn)一步研究來闡明，而BDV感染人類的病原、途徑和機(jī)制也要通過進(jìn)一步研究來發(fā)現(xiàn)。傳統(tǒng)的BDV感染區(qū)以外地區(qū)的BDV流行病學(xué)數(shù)據(jù)也必須通過標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)手段來補(bǔ)充。

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