膜片鉗技術(shù)在高血壓研究中的應(yīng)用1）

沈 燕，史慧妍，楊 沙，王 舒

膜片鉗技術(shù)（patch－clamp technique）是1976年由Nehetr和Sakroann在電壓鉗的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種記錄細(xì)胞膜離子通道電生理活動的技術(shù)。通過微電機(jī)與細(xì)胞膜之間形成緊密接觸，采用電壓鉗或電流鉗技術(shù)對生物膜上離子通道的電活動進(jìn)行記錄。膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用將細(xì)胞水平和分子水平的生理學(xué)研究聯(lián)系在一起，已成為現(xiàn)代細(xì)胞電生理研究的常規(guī)方法，使人們對于疾病和藥物作用的認(rèn)識不斷更新。膜片鉗技術(shù)用于心血管領(lǐng)域的研究也越來越多。本文擬對膜片鉗技術(shù)在高血壓病研究中的應(yīng)用作一綜述。

1 病理生理機(jī)制研究

1.1 血管平滑肌離子通道 高血壓病血壓的升高是由外周血管阻力的增加引起的。血管張力持續(xù)升高是血管舒縮活動異常所致。細(xì)胞膜離子通道的正?；顒邮茄芷交∨d奮舒縮過程的關(guān)鍵。利用膜片鉗技術(shù)觀察培養(yǎng)的或急性分離的單個細(xì)胞離子通道變化與細(xì)胞生理功能的相互作用，了解離子通道的開放特性以及某些因素對離子通道動力學(xué)特性影響。鉀離子通道是血管平滑肌上很重要的效應(yīng)蛋白，具有多種作用，通過調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖和凋亡來重塑血管是鉀通道的功能之一[1]。而且鉀通道主要是通過提供復(fù)極電流來抵消血管收縮的影響，來維持血管緊張度[2]。血管平滑肌上至少存在著四種鉀通道[3，4]，電壓依賴性 K＋通道（KV）；Ca2＋激活 K＋通道（KCa）；內(nèi)向整流K＋通道（KIR）；ATP敏感性K＋通道（KATP）。

鈣激活鉀通道是一類電壓和鈣敏感的通道，最早由Cardos描述，后來由Meech證明并報告[5]。在幾個鉀通道中，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道對血管張力和神經(jīng)元的興奮性影響最明顯，在平滑肌上表達(dá)密度最高，在平滑肌細(xì)胞膜電位的維持和肌緊張的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。當(dāng)平滑肌細(xì)胞去極化，BK通道被激活，鉀離子外流，使血管舒張，這種負(fù)反饋機(jī)制在高血壓時表現(xiàn)得尤為明顯。目前，包括腦動脈（100μm內(nèi)徑）在內(nèi)，不同類別的血管在高血壓背景下均有研究，這些結(jié)果均顯示了高血壓時血管平滑肌大電導(dǎo)鈣激防鉀通道（BKCa）電流增加[6]。12周～16周齡自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BK電流密度較WKY大鼠顯著增大[7]。且BKCa電流和電流密度隨增齡衰減，血壓水平是衰減程度的重要反應(yīng)；BKCa電流密度與血壓水平高度相關(guān)[8]。Jesica等[9]用單通道膜片鉗法記錄人內(nèi)乳動脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)p H值變化對BKCa通道有明顯影響。反映出BKCa并不是孤立的發(fā)生增齡變化，它與周圍環(huán)境的變化也是密切相關(guān)的。BK通道的增齡變化與高血壓血管重構(gòu)高度相關(guān)[10]。

除了運(yùn)用膜片鉗技術(shù)對動物平滑肌細(xì)胞的觀察以外，還有許多對人體平滑肌細(xì)胞的觀察研究。通過研究高血壓患者腸系膜血管平滑肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高血壓患者平滑肌細(xì)胞（MASMC）的BK活性顯著高于非高血壓患者[11，12]，與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合。且兩組對象在內(nèi)面向外式膜片鉗記錄下，隨著溶液中[Ca2＋]i的增高，BK明顯激活，而高血壓組 Po隨[Ca2＋]i增加的幅度明顯低于非高血壓組。這說明高血壓患者的BK對Ca2＋敏感性較低。所以高Ca2＋而增強(qiáng)的BK活動所致的血管舒張作用不能拮抗因胞外Ca2＋內(nèi)流增多所致的血管收縮作用，從而導(dǎo)致高血壓形成，而血壓狀態(tài)對BK又有著怎樣的影響，也是眾說紛紜。

采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄妊娠期高血壓疾病孕婦胎盤血管平滑肌細(xì)胞上鉀通道電流情況[13]，發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓疾病胎盤動脈血管平滑肌細(xì)胞的靜息膜電位增大，鉀電流密度減小，推測妊娠期高血壓疾病發(fā)生可能與鉀通道功能改變有關(guān)。

1.2 神經(jīng)元的放電活動 AT1受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體超級家族。它被激活后是通過何種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終影響細(xì)胞的輸出效應(yīng)或功能的，迄今仍不十分清楚。通過觀察全細(xì)胞膜片鉗以電流鉗方式記錄原代培養(yǎng)SHR和WKY新生鼠腦干和下丘腦神經(jīng)元的放電活動，發(fā)現(xiàn)AngⅡ增加SHR和WKY鼠腦神經(jīng)元放電頻率的作用均由AT1受體介導(dǎo)[14]。提示PI3激酶參與SHR鼠腦神經(jīng)元來自AT1受體的特殊信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，成為研究高血壓發(fā)生的腦源性機(jī)制的重要物質(zhì)分子，為高血壓的防治提供了又一新的途徑。

1.3 心室肌細(xì)胞 長期血壓增高可致左室心肌產(chǎn)生重構(gòu)，左心室肌細(xì)胞的電生理特性也可能發(fā)生改變。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)觀察SHR左心室肌細(xì)胞動作電位及膜離子流，發(fā)現(xiàn)SHR心室肌細(xì)胞肥大時，出現(xiàn)復(fù)極障礙，從而有助于室性心律失常的產(chǎn)生[15]。自發(fā)性高血大鼠瞬間外向性鉀流密度降低是導(dǎo)致動作電位時程延長的原因之一[16]。ⅠNa僅在心肌明顯肥厚時電流密度明顯增加，可能促進(jìn)肥厚心肌惡性室性心律失常的發(fā)生[17]。左室壓力負(fù)荷所致的肥大細(xì)胞的動作電位時程延長與L型鈣電流的失活時間延遲有關(guān)[18]。

2 抗高血壓藥物對離子通道的影響

膜片鉗技術(shù)為了解生物膜離子單通道的門控動力學(xué)特征及通透性、選擇性膜信息提供了最直接的手段，在通道電流記錄中，可分別于不同時間、不同部位（膜內(nèi)或膜外）施加各種濃度的藥物，研究它們對通道功能的可能影響，了解那些選擇性作用于通道的藥物影響人和動物生理功能的分子機(jī)制。

鉀通道開放藥（potassium channel openers，PCOs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型舒張血管平滑肌的藥物。PCOs主要通過影響KATP通道的功能而產(chǎn)生相應(yīng)的作用，其作用機(jī)制主要為激活KATP通道使鉀離子的外流增加，引起平滑肌細(xì)胞膜超極化，降低電壓依賴性鈣通道活性，從而使胞漿內(nèi)鈣離子濃度降低導(dǎo)致血管舒張，已成為抗高血壓藥物研究的重要方向之一[19]。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以觀察鉀通道開放藥對鉀通道電流的影響[20－23]，借助特定的鉀通道阻滯劑，利用膜片鉗技術(shù)可以迅速判明藥物作用靶點(diǎn)及作用方式等問題，為開發(fā)新藥提供藥理學(xué)依據(jù)。

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化，膜片鉗技術(shù)已在中醫(yī)藥研究中得到應(yīng)用，利用其理論和方法探索中藥復(fù)方和單體的藥效機(jī)制，為中醫(yī)藥防治高血壓提供了一條新的途徑。丹參復(fù)方液具有逆轉(zhuǎn)高血壓性肥大心肌L型鈣電流的藥理作用[24]。鉤藤堿（Rhy）是中藥鉤藤的主要有效成分之一，對大鼠動脈平滑肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，得出Rhy可濃度依賴性地開放BKCa，低濃度的Rhy即可增加其Po和To[25]。對人體腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Rhy在細(xì)胞貼附式下BKCa無明顯作用，在內(nèi)面向外模式下則可濃度依賴性地直接激活BKCa，且激活作用在高血壓組效果更為明顯。鬼箭羽鉤藤復(fù)方液在降低心系數(shù)的同時具有逆轉(zhuǎn)L型鈣電流的作用[26]。

3 膜片鉗應(yīng)用方法

膜片鉗主要有四種記錄方式：細(xì)胞貼附式、膜內(nèi)面向外模式、膜外面向內(nèi)模式、全細(xì)胞模式。在高血壓病的研究中，大多數(shù)用的是全細(xì)胞記錄模式，可以記錄完整細(xì)胞產(chǎn)生的點(diǎn)活動，并可研究細(xì)胞內(nèi)外液同時變化對細(xì)胞的影響。對細(xì)胞損傷小，基本上保持了細(xì)胞的生理狀態(tài)，因而藥物對某類通道的作用可以直接通過細(xì)胞的功能表現(xiàn)出來[27]。但是傳統(tǒng)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)存在機(jī)械穩(wěn)定性差，對細(xì)胞的損傷大，以及胞內(nèi)液的被滲析影響與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子通道調(diào)控有關(guān)的第二信使物質(zhì)的正常運(yùn)行，而穿孔膜片鉗技術(shù)應(yīng)用用二性霉素B或制霉菌素在細(xì)胞膜上形成特定的孔道，選擇性地允許一些離子和大分子物質(zhì)，從而使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持相對穩(wěn)定，在一定程度上彌補(bǔ)了上述缺陷，實(shí)驗(yàn)成功率也相應(yīng)提高。血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)局部鈣濃度的瞬時增加產(chǎn)生鈣火花，可激活鄰近細(xì)胞膜上由大電導(dǎo)鈣激活鉀通道開放所介導(dǎo)的自發(fā)性瞬時外向電流（spontaneous transient outward currents，STOCs），在研究豬冠脈平滑肌細(xì)胞STOCs的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)很難記錄到，即使有但持續(xù)時間較短，而采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗記錄到的概率明顯增加，且可長時間維持[28]。這一現(xiàn)象可能與傳統(tǒng)的全細(xì)胞模式中細(xì)胞內(nèi)環(huán)境受到破壞，一些影響通道調(diào)控的第二信使發(fā)生改變有關(guān)。

單通道電流記錄方法的優(yōu)點(diǎn)是對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和調(diào)制系統(tǒng)干擾最小，膜內(nèi)面向外模式是一種高血壓病研究中常用的單通道記錄方法，這種構(gòu)型下能較容易改變細(xì)胞內(nèi)的離子或物質(zhì)濃度，也能把酶等直接加于膜的內(nèi)側(cè)面，因此適用于研究胞內(nèi)激素和第二信使物質(zhì)，如1，4，5－三磷酸肌醇、c AMP、cGMP、Ca2＋等對離子通道型受體功能的調(diào)節(jié)。如在內(nèi)面向外膜片下，加入等量的前列腺素1發(fā)現(xiàn)鈣激活鉀通道被激活，并存在一定的濃度依賴性。可能與特殊位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)通道蛋白發(fā)生構(gòu)象變化增加了對鉀的通透性有關(guān)[29]。

全自動膜片鉗技術(shù)是離子通道檢測技術(shù)的最新進(jìn)展，它具有直接性、高信息量及高精確性的特點(diǎn)。近來在多個方面作出新的突破，如高的實(shí)驗(yàn)通量表現(xiàn)，較高的自動化程度、良好的封接質(zhì)量、微量加樣等。目前，該技術(shù)在以離子通道為靶標(biāo)的藥物研發(fā)、藥物毒理測試以及虛擬藥篩等方面有廣闊的應(yīng)用前景。

4 用于針灸治療高血壓病研究的探討

針灸治療高血壓病有確切療效，機(jī)制研究現(xiàn)在大多局限于對RAAS、血管活性物質(zhì)、神經(jīng)肽等方面的研究，尚未見到對離子通道影響的研究。觀察針刺干預(yù)因素的影響，可以采用兩種觀察模式：①針刺干預(yù)起效后，麻醉取組織，急性分離細(xì)胞，觀察其離子通道的特性和變化；②急性分離或培養(yǎng)的細(xì)胞，“針灸血清”作為灌流液作用于細(xì)胞或組織切片，直接觀察到針灸處理后的效應(yīng)。第一種觀察模式，因?yàn)槭轻樉钠鹦Ш笕〉貌糠纸M織或細(xì)胞，再經(jīng)過眾多處理因素，不能充分觀察針刺起效的即時效應(yīng)的機(jī)制。第二種觀察模式，可以觀察“針灸血清”直接作用于離體的細(xì)胞或組織切片，從而能夠直接地觀察針灸處理后產(chǎn)生的效應(yīng)。但是“針灸血清”如何制備、如何添加等沒有確定的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，作用機(jī)制也待進(jìn)一步研究。“針灸血清”是通過血清中一些活性物質(zhì)而發(fā)揮作用，但是針灸的效應(yīng)不單單是靠體液因素的影響，還有神經(jīng)等其他途徑的調(diào)節(jié)，所以“針灸血清”的應(yīng)用也存在一定的局限性。

5 展 望

膜片鉗技術(shù)主要是用于離子通道的觀察研究上，在細(xì)胞水平上可對通道的電學(xué)及動力學(xué)特征、藥理學(xué)特性，以及通道的調(diào)節(jié)機(jī)制開展深入的研究，可用來觀察某些因素與高血壓的關(guān)系，以及藥物作用于高血壓的靶點(diǎn)。盡管膜片鉗技術(shù)有很強(qiáng)的記錄分析功能，單純應(yīng)用仍遠(yuǎn)不足以研究解釋許多現(xiàn)象，需要與其他技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，如在血管平滑肌鈣激活鉀通道研究上，可和電生理與共聚焦同步實(shí)驗(yàn)聯(lián)合以用來證實(shí)高血壓下Ca2＋火花與自發(fā)瞬時外向電流是否有偶聯(lián)關(guān)系。隨著膜片鉗技術(shù)的進(jìn)一步完善與其他技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，其在生命科學(xué)中的應(yīng)用必將越來越顯示出其威力。

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