新型脫碳木脂素類化合物合成方法與腫瘤抑制活性研究＊

向建南，劉開建，李君姊，梁志武

（湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410082）

木脂素（Lignan）是一類基本骨架結(jié)構(gòu)為苯丙素單元的天然化合物，存在于植物的根、莖、葉和果實中.它具有抗腫瘤[1－2]、抗病毒[3－4]、抗氧化和肝臟保護[5]、抗菌消炎[6－8]、血小板活化因子（PAF）拮抗調(diào)節(jié)[9－11]生物活性.研究發(fā)現(xiàn)，帶有此類結(jié)構(gòu)單元的化合物可能具有與木脂素相似的生物活性，因此對此類化合物的合成方法及生物活性分析也成為化學(xué)家的研究熱點之一.

本實驗以芳基烯烴衍生物為原料，利用Mn（II）／Co（II）／PhP（O）HOR／O2新催化體系合成了7個脫碳木脂素類化合物（2a～2g），并利用人乳腺癌細胞 （MCF－7），人 肝 癌 細 胞 （Bel－7402），人 肺 癌（A549）和人子宮頸癌細胞（Hela）4種癌細胞采用MTT法對所合成化合物的腫瘤細胞體外抑制活性進行了評價[12].化合物合成路線見Scheme 1.

方案1 化合物2a～2g合成路線

Scheme1. Synthetic routes of compound 2a～2g

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料

所有底物均為市售；苯基二氯化磷購自天津Alfa Aesar公司；Mn（OAc）2，Co（OAc）2購自天津光復(fù)精細化工研究所；本實驗合成的新型脫碳木脂素類化合物（2a～2g）；細胞培養(yǎng)液RPMI1640，無鈣鎂PBS粉劑、胰蛋白酶、抗生素（青霉素和鏈霉素）均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；標準新生小牛血清購自美國Invitrogen公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自美國Amresco公司.

人乳腺癌細胞 MCF－7，人肝癌細胞 Bel－7402，人肺癌細胞A549，人宮頸癌細胞Hela均購自湖南湘雅醫(yī)學(xué)院細胞庫.

1.1.2 主要儀器

Beijing Taike XT－4microscopy熔點測定儀，溫度計未做校正；LCQ Advantage ion trap mass spectrometer低分辨質(zhì)譜儀，測定模式為ION source：ACPI（大氣壓化學(xué)電離，正離子模式）；Varian INOVA－400Spectometer核磁共振儀，使用TMS為內(nèi)標，CDCl3為溶劑；6孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）；XSP－15C型倒置顯微鏡（上海長方光學(xué)儀器有限公司）；HF151UV型CO2培養(yǎng)箱、HFsafe－1500型超凈工作臺（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；－80℃超低溫冰箱（合肥中科美菱低溫科技有限責任公司）；正置熒光顯微鏡（Nikon80i，Japan）；超純水制備儀（美國 Milli－Q 公司）；Multiskan MK3型酶標儀（美國Thermo公司）；TMQ.R型高壓滅菌鍋（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；5702R型低溫臺式離心機、5418低溫臺式離心機（德國Eppendorf公司）.

1.2 化合物2a～2g合成

PhP（O）HOBu參照文獻方法[13]制得，化合物2a～2g的合成方法為：在干燥的50mL三頸燒瓶中加入底物 1（1mmol）、醋 酸錳 （0.009g，0.05 mmol）、醋酸鈷（0.009g，0.05mmol），再加入25 mL乙酸作溶劑，然后加入現(xiàn)制丁基苯基亞膦酸酯（0.59g，3.0mmol），在持續(xù)通入氧氣的條件下90℃反應(yīng)24h.反應(yīng)完畢，待冷卻后加入飽和碳酸鈉溶液中和乙酸，不再有氣泡產(chǎn)生后加入乙醚萃取3次，萃取液用飽和食鹽水洗3次，再用無水硫酸鎂干燥，濃縮后經(jīng)柱色譜（200～300目）分離，得到二聚化合物2.

1.3 MTT法檢測化合物的抑制率實驗過程（以 M CF－7為例）

1.3.1 細胞復(fù)蘇

從液氮生物容器中取出MCF－7細胞株離心管，快速將其放入37℃恒溫振蕩水槽中輕微搖晃，并使MCF－7在1min之內(nèi)全部融解，然后用酒精擦拭管口消毒，打開管蓋，將MCF－7細胞懸液放入15mL離心管中，再添加10倍體積的每mL含各100單位的青霉素和鏈霉素的RPIM1640細胞培養(yǎng)液，放入離心機中在1 000r／min的速度下離心5min，取出上清液，用5mL細胞培養(yǎng)液吹打?qū)⒓毎麍F分散使其形成懸浮液，然后吸取裝入培養(yǎng)瓶，置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.3.2 接種

將對數(shù)生長期的MCF－7細胞培養(yǎng)瓶取出并倒去培養(yǎng)液，再用5mL PBS緩沖液沖洗細胞，然后再加入2mL 0.25%的胰蛋白酶放入培養(yǎng)箱中消化3 min，接著取出培養(yǎng)瓶加入11mL培養(yǎng)液反復(fù)吹打形成懸浮液，在一塊96孔板中每孔用移液槍吸取濃度為1x105個／mL的細胞懸浮液100μL，再將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h.

1.3.3 配樣

將所合成的新型脫碳木脂素類化合物分別用DMSO溶解后配制成10g／mL的溶液，再分別用培養(yǎng)液配制成5種濃度的樣品溶液100μg／mL，50μ g／mL，25μg／mL，10μg／mL，5μg／mL.

1.3.4 上樣

取出培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)板并在培養(yǎng)板每孔上樣100μL.5種濃度的樣品溶液每個濃度取4個平行孔加入。在此過程中設(shè)3組對照實驗包括空白組（僅培養(yǎng)液）、陰性組（細胞懸液、培養(yǎng)液）、受藥組（不同濃度的樣品溶液、細胞懸液、培養(yǎng)液），完成上樣后將孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h.

1.3.5 收板

將繼續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)板取出并吸取每孔中的溶液，然后用PBS緩沖液100μL反復(fù)清洗，之后每孔加入體積比為1∶1的MTT與PBS混合液40μL，再置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5h，完成后取出培養(yǎng)板并吸出MTT液，再在每孔中加入150μL DMSO并輕微振蕩以使生成的甲瓚完全溶解.

1.3.6 測值

測試方法采用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長下檢測其光吸收值并利用所得結(jié)果計算IC50值。所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x（－）±S.D），采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件（美國SPPS公司）進行單向方差分析或t檢驗.其計算公式如下：

2 結(jié)果與討論

化合物的半抑制濃度IC50值是衡量一個化合物是否具有腫瘤抑制活性的一個極為重要的數(shù)據(jù)，其值的大小直接反映了化合物腫瘤抑制活性的強弱.作者將每組實驗平行進行了3次，并根據(jù)光吸收值計算了本實驗室合成的新型脫碳木脂素類化合物2a～2g對 MCF－7，Bel－7402，A549和 Hela4種腫瘤細胞作用48h的半數(shù)抑制濃度IC50值，見表1.

從表1可以看出，采用MTT法測試的脫碳類木脂素化合物2a～2g都對腫瘤細胞產(chǎn)生了一定的抑制作用.從表中數(shù)據(jù)來看，所測腫瘤細胞中化合物2b對于各腫瘤細胞都有較好的抑制作用，并且其對于腫瘤細胞Bel－7402的半抑制濃度IC50值達到了18.9μg／mL的極低數(shù)值，遠低于做為對照組的紫杉醇在相同條件下的半抑制濃度IC50值28.0μg／mL，而紫杉醇現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物中，因此，化合物2b應(yīng)具有較好的開發(fā)前景.同時也可以看到對于癌細胞Heal，此類化合物作用效果相對較差，抑制效果最好的化合物2aIC50值也達到了48.8μg／ml.在體外抗腫瘤活性研究中，化合物作用腫瘤細胞的時間依賴性也是一個重要的標準.作者以Bel－7402為例，分別以24h和48h對此類脫碳木脂素化合物作用腫瘤細胞的時間依賴性進行了考察，如圖1所示.

表1 化合物2a～2g抗MCF－7，Bel－7402，A549和Hela的抑制活性（ˉx±S.D.，n＝3，48h）Tab.1 Cytotoxic activities of compounds 2a～2g against MCF－7，Bel－7402，A549and Hela（ˉx±S.D.，n＝3，48h）

圖1 化合物2a～2g作用Bel－7402 24h和48h的抑制活性Fig.1 Cytotoxic activities of compounds 2a～2gagainst Bel－7402with 24hand 48h

從圖中可以看出，化合物對于時間都有一定的依賴性，特別是對于化合物2a，其24h半抑制濃度幾乎為48h的兩倍，而其它化合物時間依賴性相比2a要小.

3 結(jié) 論

利用Mn（II）／Co（II）／PhP（O）HOR／O2新催化體系合成了一系列新型脫碳木脂素類化合物（2a～2g），并利用MTT法測得了所合成化合物的半抑制濃度IC50值及其與時間的關(guān)系.結(jié)果表明，此類芳基烯烴二聚化合物（2a～2g）對所測4種癌細胞均具有一定的抑制作用，并且化合物對癌細胞的作用效果有一定的時間依賴性.另外，此類化合物對人肝癌細胞Bel－7402的抑制效果尤為明顯，其中化合物2b的效果最為顯著僅為18.9μg／mL，比已被廣泛應(yīng)用于各種抗腫瘤藥物中的陽性對照組紫杉醇效果更優(yōu)，因此，化合物2b應(yīng)具有較為廣闊的研究應(yīng)用價值.

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