蒙藥材瑞香狼毒體外細(xì)胞毒性的研究

王玉華，楊夏，孫麗君，楊麗敏

瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L．）又名斷腸草、山蘿卜、紅狼毒等，蒙藥名達(dá)楞圖[1]，為瑞香科狼毒屬植物。瑞香狼毒性味苦平，毒性較大，具有逐水祛痰、破積殺蟲之功效[2]。最新研究成果表明，瑞香狼毒具有抗腫瘤、抗病毒等作用，提示瑞香狼毒將具有更廣泛的藥用價值[3]。本研究選用人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞、狗腎 MDCK 細(xì)胞作為觀察對象，采用噻唑藍(lán)（MTT）法對瑞香狼毒的各蛋白質(zhì)溶液、不同溶劑提取物及單體化合物的體外細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性進(jìn)行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 瑞香狼毒藥材采自內(nèi)蒙古武川縣西北段，經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗所康雙龍主任藥師鑒定為瑞香科狼毒屬植物；瑞香狼毒奶制品及煎膏制品為本研究所自制；石油醚、醋酸乙酯、正丁醇購自上?；瘜W(xué)試劑二廠。DG3022A 型酶標(biāo)儀為南京華東電子集團(tuán)有限公司（原國營華東電子管廠）產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)基 人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞、狗腎 MDCK 細(xì)胞購自中國科學(xué)院（北京）生命科學(xué)研究院。RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基均購自美國 GIBCO 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 不同溶劑提取物的制備 分別稱取瑞香狼毒藥材生品、奶制品、煎膏制品各 100 g，加入95% 乙醇 300 ml 超聲提取 3 次，每次 1 h，減壓回收溶劑，獲得各樣品的乙醇浸膏。取少量乙醇浸膏留樣，將剩余樣品懸浮于蒸餾水中，依次加入石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮后獲得各溶劑提取物[4]。

1.2.1.2 單體化合物的制備 取干燥的瑞香狼毒根 3.5 kg，粉碎后加入 95% 乙醇冷浸提取、濃縮后獲得總浸膏。總浸膏再依次加入石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，經(jīng)濃縮后獲得各萃取物。各萃取物再經(jīng)反復(fù)色譜分析柱分離純化，正丁醇萃取物分別獲得 6 種單體化合物，分別命名為 I～VI，即傘形花內(nèi)酯 7-O-β-D-吡喃木糖（1→6）β-D-吡喃葡萄糖苷（I）、芥子醇 1, 3′-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（II）、丁香苷（III）、落葉松樹脂醇 4, 4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（IV）、松樹脂醇 4, 4′-O-雙-β-D-吡喃葡萄糖苷（V）、丁香樹脂醇-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（VI）；醋酸乙酯萃取物則分別獲得 3 種單體化合物，分別命名為 VII～I(xiàn)X，即西瑞香素（VII）、狼毒色原酮（VIII）、異狼毒素（IX）。

1.2.1.3 蛋白質(zhì)的制備[5]稱取瑞香狼毒藥材1.5 kg，用純化水冷浸提取 24 h 后，過濾、濃縮。濃縮液再經(jīng)鹽析、透析后獲得瑞香狼毒總蛋白質(zhì)。

將總蛋白質(zhì)通過凝膠柱分離純化、SDS-PAGE電泳法測定相對分子質(zhì)量，獲得相對分子質(zhì)量分別為 14400、35000、28000、23000、10000、94000的 6 個蛋白質(zhì)組分，分別命名為蛋白質(zhì)-1（Pr.1）、蛋白質(zhì)-2（Pr.2）、蛋白質(zhì)-3（Pr.3）、蛋白質(zhì)-4（Pr.4）、蛋白質(zhì)-5（Pr.5）、蛋白質(zhì)-6（Pr.6）。

1.2.2 樣品溶液的制備

1.2.2.1 不同溶劑提取物及各單體化合物溶液的制備 稱取各樣品適量，加入 3 ml 蒸餾水，制成終濃度為 2.0 mg/ml 的水溶液，置于 4 ℃ 冷藏，備用。

1.2.2.2 總蛋白質(zhì)溶液的制備 稱取總蛋白質(zhì)適量，加入 3 ml 蒸餾水，制成終濃度分別為 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/ml 的水溶液，經(jīng) 0.45 μm無菌濾膜過濾后，置于 4 ℃ 冷藏，備用。

1.2.2.3 各蛋白質(zhì)組分溶液的制備 稱取相對分子質(zhì)量不同的各蛋白質(zhì)組分適量，加入 3 ml 蒸餾水，制成終濃度均為 10 mg/ml 的水溶液，經(jīng)0.45 μm 無菌濾膜過濾后，置于 4 ℃ 冷藏，備用。

1.2.3 細(xì)胞增殖活性測定 采用 MTT 法進(jìn)行檢測[6]。將人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞、狗腎 MDCK細(xì)胞分別置于 RPMI 1640 和DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的 2 種細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，分別加入相應(yīng)的 RPMI 1640 和DMEM 培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1 × 105個/ml，以 100 μl/孔接種于 96 孔培養(yǎng)板中。實驗組分別加入不同劑量的各瑞香狼毒樣品溶液，其中蛋白質(zhì)溶液劑量均為 100 μl，各單體化合物和不同溶劑提取物溶液的劑量分別為 100、50、20 μl；同時以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對照組，每組 4 個平行孔。將 96 孔板培養(yǎng)板置于 37 ℃、5% 飽和濕度的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 96 h 后，棄培養(yǎng)基。每孔加入 MTT 溶液（0.20 mg/ml）20 μl，37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，670 × g 離心 5 min，棄去上清液。每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μl，振蕩 5 min使沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀測定波長 490 nm 處吸光度（A490）值，并按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率：抑制率（%）=（l － 實驗組平均 A490值/空白對照組平均 A490值）× 100%。

2 結(jié)果

2.1 瑞香狼毒蛋白質(zhì)生物活性

以不同濃度的瑞香狼毒總蛋白質(zhì)溶液和相對分子質(zhì)量不同的各蛋白質(zhì)組分溶液分別作用于人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞、狗腎 MDCK 細(xì)胞，結(jié)果顯示瑞香狼毒總蛋白質(zhì)及其組分均具有一定的抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性，且抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性隨總蛋白質(zhì)濃度增加而增強(qiáng)。而在相同濃度下，6 個蛋白質(zhì)組分中有 4 個蛋白質(zhì)組分對人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其活性由強(qiáng)至弱依次為：Pr.4 ≥ Pr.6 ≥ Pr.3 = Pr.2；有 3 個蛋白質(zhì)組分對狗腎 MDCK細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，其毒性由強(qiáng)至弱依次為：Pr.4 ≥ Pr.3 ≥ Pr.1（表 1）。

表1 瑞香狼毒蛋白質(zhì)溶液的細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性（n = 10）Table 1 The cytotoxicity and anti-tumor activity of Stellera chamaejasme L.protein solution (n = 10)

2.2 瑞香狼毒單體化合物的生物活性

以劑量分別為 100、50、20 μl 的瑞香狼毒各單體化合物溶液（2.0 mg/ml）分別作用于人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞、狗腎 MDCK 細(xì)胞，結(jié)果顯示在分離獲得的 9 個單體化合物中，西瑞香素（VII）、狼毒色原酮（VIII）、異狼毒素（IX）對人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的抗腫瘤活性，而狼毒色原酮（VIII）、異狼毒素（IX）則對狗腎 MDCK細(xì)胞同時具有較弱的細(xì)胞毒性（表 2）。

2.3 瑞香狼毒不同溶劑提取物的生物活性

以劑量分別為 100、50、20 μl 的瑞香狼毒生品及炮制品各溶劑提取物溶液（2.0 mg/ml）分別作用于人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞、狗腎 MDCK 細(xì)胞，結(jié)果顯示除煎膏制品正丁醇提取物無抗腫瘤活性外，生品及炮制品的乙醇和正丁醇提取物均具有不同程度的抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性，并呈藥物劑量依賴性；生品及炮制品的醋酸乙酯提取物則均無抗腫瘤活性，僅具有不同程度的細(xì)胞毒性，并呈藥物劑量依賴性；生品的石油醚和多糖提取物均未呈現(xiàn)抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性。同時與生品相比，在保留一定程度抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上，炮制品相應(yīng)各溶劑提取物的細(xì)胞毒性均有所降低（表 3）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，瑞香狼毒總蛋白質(zhì)及其組分均具有一定程度的細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性。當(dāng)總蛋白質(zhì)溶液濃度增大至 2.0 mg/ml 時，呈現(xiàn)抗腫瘤活性；當(dāng)總蛋白質(zhì)溶液濃度進(jìn)一步增大至 4.0 mg/ml時，其抗腫瘤活性增強(qiáng)的同時也出現(xiàn)一定程度的細(xì)胞毒性，且抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性均隨總蛋白質(zhì)溶液濃度的增加而增強(qiáng)，提示蛋白質(zhì)可能是瑞香狼毒的主要毒性位點之一。

表2 瑞香狼毒單體化合物的細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性（n = 10）Table 2 The cytotoxicity and anti-tumor activity of Stellera chamaejasme L.monomer compounds (n = 10)

表3 瑞香狼毒不同溶劑提取物的細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性（n = 10）Table 3 The cytotoxicity and anti-tumor activity of different solvent extracts of Stellera chamaejasme L.(n = 10)

除石油醚和多糖提取物外，瑞香狼毒不同溶劑提取物均表現(xiàn)出不同程度的抗腫瘤活性和細(xì)胞毒性，并呈藥物劑量依賴性；而瑞香狼毒藥材經(jīng)炮制后，在保留一定程度抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上，其相應(yīng)各溶劑提取物的細(xì)胞毒性均有所降低。此外，瑞香狼毒的臨床用藥方式主要為外用，且要求炮制后應(yīng)用，通常用藥時將瑞香狼毒根奶制品粉末與成方的其他藥味粉末混合，加入適當(dāng)?shù)娜軇ㄋ?、食用醋或雞蛋清）調(diào)成糊狀用于患病部位。本研究從瑞香狼毒中分離獲得的各單體化合物，多數(shù)無細(xì)胞毒性，提示瑞香狼毒的細(xì)胞毒性主要來自于多成分的協(xié)同作用，而這也與其上述臨床用藥過程相吻合。

總之，本研究通過體外實驗觀察，證實了瑞香狼毒的細(xì)胞毒性主要源自多成分的協(xié)同作用，而炮制的方法既可以降低毒性，又可以保留其生物活性，為炮制方法被臨床采用提供了理論依據(jù)。

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