新疆南疆豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株分型鑒定

崔浩然 劉永宏 趙 麗 焦海宏 張志峰 劉俊峰

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾市，843300)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV)引起豬的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均可感染，但以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最易感，該病以母豬的流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬的呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征[1]。

目前，PRRS嚴(yán)重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)和世界公共衛(wèi)生，給經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的損失，僅美國(guó)因該病每年至少要花費(fèi)5.6億美元[2]，權(quán)威組織評(píng)價(jià)每頭生長(zhǎng)豬出欄前因PRRS花費(fèi)5.60美元～7.60美元。

2006年春夏之交，我國(guó)從南向北25個(gè)以上省、市、自治區(qū)暴發(fā)以高熱、高發(fā)病率、高死亡率和低治愈率為特征的“豬高熱病(porcine high fever disease，PHFD)”，至少200多萬(wàn)頭豬發(fā)病，死亡40萬(wàn)頭之多，2007年7月田克恭等及農(nóng)業(yè)部[3]將其確診為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly Pathogenicity Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，HP－PRRS)，JXA1株為HP－PRRSV代表株，屬于美洲型。并將HP－PRRS確定為中國(guó)一類動(dòng)物疫病[3]，普通毒力的PRRS確定為中國(guó)二類動(dòng)物疫病。

PRRSV為單股正鏈RNA病毒，根據(jù)抗原性差異將各地PRRSV分離株分為兩個(gè)型，即歐洲型(Ⅰ型)和美洲型(Ⅱ型)，原型株分別為L(zhǎng)V株和ATCC VR－2332株[4]。PRRSV基因組全長(zhǎng)約15kb，至少編碼9個(gè)相互重疊的開(kāi)放閱讀框架(Open reading frame，ORF)，即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7[5]。ORF5、ORF6和ORF7編碼三個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別為被膜蛋白GP5、膜蛋白M和核衣殼蛋白N[5]。和歐洲型原型株LV株相比，北美型N蛋白核苷酸同源性僅約63%，氨基酸同源性僅約59%的水平[6]。如此相對(duì)高的偏離原因?yàn)槎鄠€(gè)核苷酸置換、插入和缺失引起，使北美型N蛋白比歐洲型LV株少了5個(gè)氨基酸[7] 。

考慮新疆南疆周鄰多國(guó)的地理位置、戈壁沙漠地域較廣和干旱氣候等特點(diǎn)，以及PRRSV高變異性[7]和抗體依賴性增強(qiáng)[8]等特點(diǎn)，新疆南疆毒株可能有其自身的、不同于國(guó)內(nèi)外其他毒株的特點(diǎn)。本研究擬針對(duì)新疆南疆PRRSV ORF7部分因序列進(jìn)行遺傳演化分析，討論所得毒株類型，為新疆南疆有效防制PRRS提供依據(jù)和技術(shù)儲(chǔ)備。現(xiàn)結(jié)果報(bào)告如下:

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

采自新疆南疆阿克蘇和庫(kù)爾勒地區(qū)發(fā)病自然死亡豬只。陽(yáng)性對(duì)照為上海海利/藍(lán)耳病活疫苗/高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(HuN4－F112株)。

1.1.2 主要試劑盒

Trizol invitrogenTM(Code No.:15596－026)，購(gòu)自Invitrogen生物工程有限公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.:DRR019A)，Premix Taq Version2.0(Code No.:D331A)，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;TIANgel Midi Purification Kit(Code No.:DP209)，TIANprep Mini Plasmid Kit(Code No.:DP103)，pGM－T克隆試劑盒(Code No.:VT202)，DNA markerⅡ(Code No.:MD102)，DNA markerⅢ(Code No.:MD103)均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;等。

1.1.3 PRRSV參考毒株

PRRSV參考毒株均下載于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，毒株名稱、大小和GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1。

1.1.4 引物

按照引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier5.0分子生物學(xué)軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中保守的PRRSV基因序列為參照設(shè)計(jì)特異性引物，跨度300bp左右，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。具體序列如下:上游引物:5'－AATGGCCAGCCAGTCAATCA－3';下游引物:5'－GAATCAGGCGCACTGTATGA－3'。

表1 參考毒株

1.1.5 儀器

PCR儀(TC－5000，Bibby scientific Ltd)，小型高速冷凍離心機(jī)(R134a，Hermetically sealed refigeration system)，電泳儀(DYY－12，北京市六一儀器廠)，紫外分析儀(JY02S，北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司)，等。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

從病死豬肺臟等混合組織中提取總RNA，按Trizol invitrogenTM試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 RT－PCR反應(yīng)

總RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒，利用自行設(shè)計(jì)的特異性引物，進(jìn)行一步法擴(kuò)增ORF7基因片段，退火溫度54.1℃。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(弱毒疫苗)和陰性對(duì)照(蒸餾水)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化回收

取ORF7基因RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳切膠后，按照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行回收純化。

1.2.4 純化產(chǎn)物連接T載體

膠回收純化目的產(chǎn)物與pGM－T載體連接，按照pGM－T克隆試劑盒說(shuō)明操作。

1.2.5 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞、鑒定、搖菌及提取質(zhì)粒送測(cè)序

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化自制的感受態(tài)細(xì)胞DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。白色菌落利用Premix Taq?Version2.0試劑盒進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑取多個(gè)PCR陽(yáng)性菌落搖菌，按照TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒提取質(zhì)粒DNA，標(biāo)記為XJNJ－4－1、XJNJ－4－3、XJNJ－5－2、XJNJ－5－3、XJNJ－9－1、XJNJ－9－2、XJNJ－13－1、XJNJ－13－2、XJNJ－14－1、XJNJ－14－3、XJNJ－18－1、XJNJ－18－2、XJNJ－19－2和XJNJ－19－3，送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為T(mén)7。

1.2.6 序列分析

用DNAMAN和DNAStar生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳演化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF7基因RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用ORF7基因特異性引物，對(duì)發(fā)病疑似PRRS豬組織病料總RNA進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，14例PRRSV陽(yáng)性，分別命名為PRRSV XJNJ－4－1、XJNJ－4－3、XJNJ－5－2、XJNJ－5－3、XJNJ－9－1、XJNJ－9－2、XJNJ－13－1、XJNJ－13－2、XJNJ－14－1、XJNJ－14－3、XJNJ－18－1、XJNJ－18－2、XJNJ－19－2和XJNJ－19－3株，得到的目的基因片段與預(yù)期的大小一致，對(duì)照成立(圖1)。

圖1 ORF7基因RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 ORF7基因核苷酸序列比較分析

RT－PCR陽(yáng)性產(chǎn)物膠回收純化，連接pGM－T載體，轉(zhuǎn)化自制的感受態(tài)細(xì)胞DH5α，白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑取PCR陽(yáng)性菌落搖菌，提取質(zhì)粒DNA，送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，獲得了14個(gè)ORF7基因部分片段序列。

本研究獲得的14個(gè)新疆南疆PRRSV毒株與6個(gè)國(guó)內(nèi)代表毒株(2006年中國(guó)暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl，中國(guó)另外一個(gè)HP－PRRSV毒株HuN，中國(guó)自然弱毒疫苗株R98，JXA1致弱株JXA1 P80和中國(guó)代表株CH－1a及其致弱株CH－1R)和3個(gè)國(guó)外代表株(進(jìn)口美洲型疫苗株MLV，美洲型代表毒株VR2332和歐洲型代表毒株LV)相應(yīng)的ORF7基因序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示本研究獲得的14株、國(guó)內(nèi)6株參考株以及進(jìn)口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332都不存在9個(gè)堿基的缺失，只有歐洲型代表毒株LV該位置有9個(gè)堿基的缺失，結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)相符(圖2)。

圖2 ORF7片段中核苷酸的缺失

2.3 ORF7基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹(shù)

將本研究獲得的14個(gè)PRRSV毒株ORF7基因部分片段，與參考的9株P(guān)RRSV截取相應(yīng)位置長(zhǎng)度的ORF7基因序列，進(jìn)行核苷酸比對(duì)，繪制了23個(gè)毒株的發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。如圖3所示，本研究的14株均與中國(guó)代表株CH－1a及其致弱株CH－1R、2006年中國(guó)暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80、中國(guó)另外一個(gè)高致病性毒株HuN、中國(guó)自然弱毒疫苗株R98、進(jìn)口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332在同一個(gè)大的分支，均不與歐洲型代表株LV在一個(gè)分支。另外，XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株與2006年中國(guó)暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80和中國(guó)另外一個(gè)高致病性毒株HuN在同一個(gè)小的分支內(nèi)。

3 討論

1996年郭寶清等[9]首次從北京流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離到PRRSV，從而證實(shí)PRRS已在我國(guó)存在。隨后，該病在中國(guó)各省市相繼均有報(bào)道。2006年，中國(guó)豬養(yǎng)殖場(chǎng)由南向北暴發(fā)一次毀滅性災(zāi)難－HPPRRS。中國(guó)新疆其他省市對(duì)PRRS研究較多，新疆對(duì)該病的研究屬于探索階段。新疆地處中國(guó)西北邊陲，周邊與8國(guó)接壤，尤其在俄羅斯流行PRRSV歐洲型毒株，與中國(guó)流行的美洲型毒株有明顯差異。另外，中國(guó)臺(tái)灣[10]、中國(guó)內(nèi)地檢疫口岸以及內(nèi)地一些地區(qū)有歐洲型毒株的報(bào)道。之前的研究，兩洲分離株屬于兩個(gè)不同的基因型，各洲野外分離株和各洲起源株有高度的親緣關(guān)系，亞洲國(guó)家PRRSV遺傳學(xué)關(guān)系顯示為美洲型[11]。近年來(lái)，PRRSV的流行早已打破原來(lái)的地域限制，在亞洲和北美均有歐洲型PRRSV流行的報(bào)道，歐洲也出現(xiàn)了野生型PRRSV的美洲株。所以，有必要研究分析清楚新疆南疆PRRSV流行毒株的類型及特點(diǎn)，以便于更好的預(yù)防和控制新疆南疆PRRS。對(duì)于PRRSV的相關(guān)基因的變異性研究是十分必要的，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行合理的種毒株選擇，疫苗設(shè)計(jì)和制備，以便提出有效的防控措施和防制計(jì)劃。

PRRSV的ORF7基因，是除ORF6基因以外保守性最高的編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因[12]，美洲型毒株間氨基酸的同源性為96%～100%，歐洲型毒株間氨基酸同源性為94%～99%，但歐洲型與美洲型毒株之間N蛋白氨基酸的同源性僅為63%，氨基酸同源性僅為59%[6]。本研究針對(duì)相對(duì)保守的ORF7基因，設(shè)計(jì)了可以同時(shí)擴(kuò)增歐洲型和美洲型PRRSV毒株ORF7基因部分片段的特異性引物，擴(kuò)增片段包括歐洲型毒株9個(gè)核苷酸片段的缺失區(qū)，針對(duì)此用于區(qū)分歐洲型和美洲型毒株。同時(shí)，本研究病料均采自新疆南疆發(fā)病疑似PRRS豬只，且均來(lái)自未免疫PRRS弱毒疫苗豬場(chǎng)，所以此次陽(yáng)性結(jié)果表明該豬場(chǎng)存在PRRSV感染。本研究通過(guò)RT－PCR有14例PRRSV陽(yáng)性，說(shuō)明該組織樣品來(lái)源豬場(chǎng)存在PRRSV感染。RT－PCR陽(yáng)性產(chǎn)物克隆測(cè)序獲得的14個(gè)ORF7基因片段，均沒(méi)有該位置9個(gè)核苷酸的缺失。同時(shí)結(jié)合參考的9株P(guān)RRSV代表株，截取相應(yīng)位置長(zhǎng)度的ORF7基因序列，進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)得到的進(jìn)化樹(shù)顯示，本研究的14株均與中國(guó)代表株CH－1a及其致弱株CH－1R、2006年中國(guó)暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80、中國(guó)另外一個(gè)高致病性毒株HuN、中國(guó)自然弱毒疫苗株R98、進(jìn)口美洲型疫苗株MLV和美洲型代表毒株VR2332在同一個(gè)大的分支，均不與歐洲型代表株LV在一個(gè)分支。以上結(jié)果綜合表明，本研究采集樣品豬場(chǎng)感染了PRRSV美洲型毒株，同時(shí)說(shuō)明這些豬場(chǎng)沒(méi)有感染歐洲型毒株。

另外，進(jìn)化樹(shù)顯示XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株與2006年中國(guó)暴發(fā)HP－PRRS代表株JXAl及其致弱株JXAl P80和中國(guó)另外一個(gè)高致病性毒株HuN在同一個(gè)小的分支內(nèi)，因?yàn)楸狙芯坎×暇勺晕疵庖逷RRS弱毒疫苗豬場(chǎng)，所以XJNJ－5－2和XJNJ－5－3株屬于高致病HP－PRRSV毒株

至于更準(zhǔn)確的結(jié)論，以及新疆南疆更多毒株的獲得及毒株特點(diǎn)分析，會(huì)在將來(lái)的工作中逐步進(jìn)行，從采樣點(diǎn)全面、毒株數(shù)量多等方面考慮，最終監(jiān)測(cè)新疆南疆PRRSV毒株類型及特點(diǎn)，以便及早的發(fā)現(xiàn)新毒株和新特點(diǎn)，提出更加有效的防制對(duì)策，減少因PRRS造成新疆南疆養(yǎng)豬業(yè)損失。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到歐洲型毒株，獲得的14個(gè)新疆南疆地區(qū)PRRSV毒株均屬于美洲型毒株，其中2株屬于美洲型高致病性HP－PRRSV毒株。

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