表觀健康的豬肉攜帶豬鏈球菌的調查

臧瑩安，謝樂新，李家僑，龐木生，李 淼，宋 帥，李春玲

（1.仲愷農業(yè)工程學院動物科學系，廣東 廣州 510225；2.廣東省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東省動物疫苗供應站，廣東 廣州 510225）

豬鏈球菌?。⊿S）是由豬鏈球菌引起的人獸共患傳染性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)及公共衛(wèi)生安全構成了嚴重的威脅。人和豬感染發(fā)病的臨床癥狀相似。以往對豬肉進行食品安全檢測的項目多集中在致瀉大腸桿菌、沙門菌、單增李斯特菌等食源性病原菌，檢測過程中，偶爾也能分離到鏈球菌，但多數(shù)是沒有致病性的［1-2］。在經(jīng)濟高度發(fā)達的時代，食品安全越來越成為人們關注的焦點，本次通過對廣州大型農貿市場銷售的屠宰豬肉的隨機抽樣，初步了解表觀健康的豬肉攜帶豬鏈球菌的情況和耐藥性情況，為防范食源性豬鏈球菌病感染人及耐藥性的傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 PCR儀，DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)-Tanon-1600，F(xiàn)ast win臺式離心機Fc-16c，SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺，HZQ-X100震蕩培養(yǎng)箱，均購自杭州博日科技有限公司。

1.2 主要試劑 新生牛血清，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；血平板，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；托-休二氏液體培養(yǎng)基（Todd-Hewitt broth，簡稱THB）和托-休二氏固體培養(yǎng)基（Todd-Hewitt Agar，簡稱THA）均為自行配制。豬鏈球菌分型試劑盒、藥敏試驗紙片和豬鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

根據(jù)豬鏈球菌2型溶血素基因設計引物，PCR引物序列為：GTTGAGTCCTTATACACCTGTT，CAGAAAATTCATATTGTCCACC

1.3 樣品的采集 2010年7～8月，在廣州某大型農貿市場集中采集樣品66份，用消毒后的手術刀切開豬肉暴露切口，再用滅菌棉簽拭豬肉的新鮮切口，放入裝有1mLTHB液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃恒溫搖床180r／min中震蕩培養(yǎng)18h。

1.4 豬鏈球菌的分離 在超凈工作臺中采用劃線分離培養(yǎng)法用接種環(huán)挑取菌液接種于血平板上，37℃培養(yǎng)14～16h，經(jīng)培養(yǎng)無雜菌者，選取α溶血、光滑圓形、半透明、直徑1～2mm的小菌落，每個樣品挑去3～6個疑似菌落，分別接種3mL THB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～18h后，仔細觀察分離菌經(jīng)培養(yǎng)后的生長情況，并挑取單個可疑菌落和液體培養(yǎng)物分別作革蘭染色鏡檢。

1.5 豬鏈球菌的PCR鑒定 利用16SrRNA的PCR檢測豬肉中的豬鏈球菌，具體步驟如下。

PCR擴增采用25μL反應體系。在反應管中依次加入 10×PCR Buffer 2.5μL、25 mmol／L MgCl22.0μL、2.5 mmol／L dNTPs 2.0μL、10 pmol／μL引物1.0μL、模板1.0μL、5U／μL Taq酶0.5μL，然后加ddH2O調整終體積至25μL。94℃變性5min后進入循環(huán)，94℃0s，60℃1min，72℃1.5min，35個循環(huán)后72℃保溫10min。將得到的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。取6.5μL PCR產(chǎn)物和1μL 6×Buffer上樣緩沖液充分混勻置2.0%瓊脂糖凝膠 （含溴化乙錠替代物Goldview）電泳。電壓5V／cm，電流130mA，用凝膠成像儀觀察結果并拍照。

1.6 豬鏈球菌的生化試驗 將分離的菌株接種于THB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)16～18h，用1mL滅菌注射器各吸取0.05～0.08mL（約1～2滴）的菌懸液加入每種微量發(fā)酵管。放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。記錄結果。

1.7 豬鏈球菌的血清分型 分離出來的豬鏈球菌，采用凝集的方法進行分型［3］。

1.8 豬鏈球菌的分群 按豬鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒說明書進行。

1.9 豬鏈球菌的藥敏試驗 采用紙片擴散法進行［4］。

2 試驗結果

2.1 豬肉中豬鏈球菌的陽性率 66份表觀健康的豬肉，經(jīng)PCR擴增確定9份為豬鏈球菌陽性樣品，總體陽性率為13.6%。

2.2 豬鏈球菌的生化試驗 分離到的9株豬鏈球菌發(fā)酵乳糖，血清菊糖，棉子糖，七葉苷，水楊素，海藻糖；不發(fā)酵6.5%NaCl，馬尿酸鈉，甘露醇，山梨醇。

2.3 豬鏈球菌的血清型分型結果 9株豬鏈球菌采用凝集的方法進行血清型分型，確定其中8型，9型，18型，26型各1株，27型3株，32型2株。

2.4 豬鏈球菌的分群結果 9株豬鏈球菌分群的結果：確定5株是C群，4株是D群。

2.5 豬鏈球菌的藥敏試驗結果 見表1。

表1 藥敏試驗結果 （mm）

由表1可知，分離到的9株鏈球菌對12種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，且以多重耐藥為主。鏈球菌對同一種藥物的敏感性有很大的差異，總體來說分離的菌株對頭孢唑啉，先鋒Ⅵ ，阿莫西林，氟苯尼考，奧復星高度敏感；對青霉素中度敏感；對強力霉素，四環(huán)素，新霉素，菌必治，復方新諾明和磺胺異惡丙唑耐藥。

3 討論與分析

本次從廣州某大型農貿市場采集了66份表觀健康的豬肉，采用PCR的方法進行檢測，豬鏈球菌的陽性率達到了13.6%。此次試驗不同于其他試驗從豬的扁桃體，脾臟或者血液中檢測豬鏈球菌的攜帶情況，而是考慮到食品的安全和人體健康，直接從表觀健康的豬肉中進行豬鏈球菌檢測的。2010年從上海屠宰豬扁桃體中調查豬鏈球菌感染率，取樣231份樣品中共確定24份豬鏈球菌，陽性率達到10.4%［5］。相比之下，屠宰豬扁桃體和表觀健康的豬肉中豬鏈球菌的陽性率基本一致，說明豬鏈球菌的攜帶方式不僅僅是內臟或者血液，豬肉中也同時攜帶豬鏈球菌。豬鏈球菌是急性熱性人獸共患傳染病，而豬肉作為日常生活中不可或缺的肉制品，為了保證食品的安全和人體的健康，確實是有待加強豬鏈球菌病的監(jiān)測和防控工作。

生化試驗的結果是能發(fā)酵乳糖，血清菊糖，棉實糖，七葉苷，水楊素，海藻糖；不發(fā)酵6.5%NaCl，馬尿酸鈉，甘露醇，山梨醇。從生化試驗的結果來看，這與其他省、市所報道的豬鏈球菌主要流行群基本一致，本試驗驗菌株的生化特性與其他報道［6-7］沒有區(qū)別，生化指標可作為細菌鑒定的一個參考。同時也佐證了PCR方法作為豬鏈球菌鑒定方法的準確性和精確性。

豬鏈球菌的血清型有1～34型和1／2型，共35種血清型［8］，在分離到的陽性的菌株采用血清凝集試驗進行血清分型，確定其中8型，9型，18型，26型各1株，27型3株，32型2株。雖然這次試驗并沒有發(fā)現(xiàn)嚴重危害人類健康的2型豬鏈球菌，但是從豬肉中檢出2型豬鏈球菌的例子是屢見不鮮。2007年從非法屠宰的豬肉中檢出豬鏈球菌2型，由公安部門和獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督部門查獲和送檢的，推斷在屠宰前該批豬就已感染豬鏈球菌2型，或是屠宰前就是豬鏈球菌2型病死豬，送檢時豬肉可能受到血液或實質器官污染［9］。

本次從豬肉中分離到的9株豬鏈球菌對12種抗菌藥物的敏感性有一定的差異性，呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，且以多重耐藥為主。總體來說分離的菌株對頭孢唑啉，先鋒Ⅵ，阿莫西林，氟苯尼考，奧復星高度敏感；對青霉素中度敏感；強力霉素，四環(huán)素，新霉素，菌必治，復方新諾明和磺胺異惡丙唑呈耐藥。此次的試驗說明，豬鏈球菌都產(chǎn)生多重耐藥性。這給臨床治療帶來了很大的困難，嚴重威脅著人類和動物的生命及健康安全，也給新藥的開發(fā)帶來了巨大的壓力。建議豬場在防治豬鏈球菌病時，對菌株進行藥敏試驗，根據(jù)試驗結果用2～3種敏感藥物按療程和足夠的劑量交替使用。

［1］李春玲，余煒烈，王貴平.豬鏈球菌扁桃體分離株的毒力因子分布特征與致病性［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2009（2）：645-648.

［2］倪艷秀，何孔旺，王繼春，等.檢測豬鏈球菌2型的溶菌酶釋放蛋白（MRP）的PCR方法的建立［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2001，23（1）：20-22.

［3］高志勇，莊輝.人-豬鏈球菌病研究進展［J］.中華流行病學雜志，2005（9）：645-648.

［4］陳澤祥，吳禮結，許力干，等.廣西豬源鏈球菌分離株的分群鑒定［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2005，32（12）：38-40.

［5］Han D U，Choi C，Ham H J，et al.Prevalence，capsular type and antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from slaughter pigs in Korea［J］.Can J Vet Res，2001，65（3）：151-155.

［6］王麗平，陸承平，唐家琪.鏈球菌對大環(huán)內酯類抗生素的耐藥性及耐藥表型［J］.南京農業(yè)大學學報，2004，27（4）：81-84.

［7］閆若潛，趙明軍，張志凌，等.河南省致病性豬鏈球菌血清型及耐藥性狀況調查［J］.河南畜牧獸醫(yī)，2007，28（5）：25-27.

［8］田云，孫彥偉.豬鏈球菌鑒定方法的研究進展［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2006，31（4）：6-8.

［9］李小軍，張?zhí)K華，劉佩紅，等.從非法屠宰的豬肉中檢出豬鏈球菌2型［J］.畜牧與獸醫(yī)，2007，39（8）：45-48.