豬附紅細胞體不同診斷方法的比較

潘樹德，李學儉，張 良，席 東

（沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110866）

附紅細胞體病是由附紅細胞體寄生于人和多種動物的紅細胞表面、血漿及骨髓內的一種以紅細胞壓積降低、血紅蛋白濃度下降和白細胞增多、貧血、黃疸、發(fā)熱為主要臨床特征的人畜共患傳染病。目前豬的附紅細胞體病己越來越引起我國養(yǎng)豬者的重視。近年來，我國豬附紅細胞體病的發(fā)生和流行呈明顯的上升趨勢，有些省份為暴發(fā)性流行，尤其是對仔豬的危害更為嚴重。

2010年11月，沈陽市法庫縣某養(yǎng)豬戶從外地購進體重約7.5～20kg，大小不一的仔豬110頭，30 d后同群中較大的豬開始發(fā)病，后全群相繼發(fā)病。就診時已發(fā)病70頭，死亡10頭。

臨床癥狀：病豬精神委頓，被毛粗亂，食欲不振，雙眼無神，結膜蒼白、貧血、黃疸明顯；體溫40℃～41.5℃，仔豬開始便秘，糞便前期干燥，后排下黃色稀糞，嚴重時呈水樣；全身皮膚發(fā)紅，耳尖、腹部、頸部及四肢有紫紅色斑塊，指壓不退色，呼吸急促，流漿性、黏稠鼻液。

病理變化：剖檢病死豬可見全身淋巴結水腫，切面邊緣出血，斷面呈大理石樣花紋出血；脾臟邊緣有梗死病灶；胃腸道均有不同程度的出血、充血，回盲口附近有輪層狀、紐扣狀潰瘍灶；腎臟表面有針尖大小的出血點；部分膀胱黏膜有出血點；肝臟呈土黃色；膽汁黏稠；肌肉色淡；血液凝固不良。

根據臨床癥狀和病理變化可初步診斷為豬瘟和附紅細胞體的混合感染，現對豬附紅細胞體的實驗室診斷及該群豬的治療敘述如下。

1 材料與方法

1.1 材料 血液樣品 采自法庫某農戶豬場的病豬。

試劑：吖啶黃、枸櫞酸、堿性品紅、濃鹽酸、瑞氏染液、姬姆薩染液、甲醇、磷酸氫二鈉、偏亞硫酸鉀、活性碳、固綠、吖啶橙等。

主要設備：OLYMPUS倒置顯微鏡；OLYMPUS熒光顯微鏡；普通光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 取病豬血 豬附紅細胞體病待檢血液采自自然發(fā)病的附紅細胞體患豬的靜脈血。

1.2.2 鮮血壓片鏡檢 將1滴靜脈血滴于載玻片上，加等量的生理鹽水稀釋，降低血漿黏度，防止血液中紅細胞重疊密集，以便觀察。在400倍顯微鏡下找到紅細胞后，待血液停止流動后，即可觀察。

1.2.3 姬姆薩染色 姬姆薩染色液的配制：取姬姆薩染料0.6g，加入50mL甘油內，于56℃下加熱2 h，然后加入甲醇50mL，于3～5d后過濾，即為原液。使用時與各種pH值的PBS以1∶20的比例混合，即為染色液。

染色：無菌采取豬靜脈血，與阿氏液1∶1混合。推片、干燥后用甲醇固定，待甲醇揮發(fā)干凈后將玻片浸于不同pH值的染色缸中，每種pH值放4張，并分別于6、12、18、24h后進行觀察。

1.2.4 瑞氏染色 瑞氏染色液的配制：取瑞氏染料0.1g置乳缽中，徐徐加入甲醇，研磨以促其溶解。將溶液傾入有色中性玻瓶中，并數次以甲醇洗滌乳缽，亦傾入瓶內，最后使全量為60mL即可。將此瓶置暗處過夜，次日過濾即成。

染色：推片自然干燥后，滴加瑞氏染色液，染色3min，然后加等量蒸餾水再染5min，蒸餾水沖洗。

1.2.5 吖啶橙染色 吖啶橙染色液的配制：將0.01g吖啶橙溶于100mL 0.05mol／L，pH值7.5的Tris-HCl緩沖液中。

染色：將涂有標本的玻片用甲醇固定，待甲醇揮發(fā)干凈后將玻片置濕盒內，加適量吖啶橙染液，37℃、10min。用pH值7.4的PBS輕輕沖洗，溶液分色2min，用PBS洗滌2次，直接在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 治療 對全群豬進行緊急免疫，用脾淋苗加免疫增效劑新必妥1∶1稀釋后每豬肌肉注射2頭份。

全群豬按阿莫西林250mg／kg加土霉素1000 mg／kg拌料連用7d，嚴重病豬用血蟲凈1g，用生理鹽水稀釋成5%濃度，每千克體重10mg，肌肉注射，每日1次，連用2d，隔日再肌肉注射1次。同時用復合維生素B和維生素C飲水。飲水中添加黃芪多糖粉和電解質。

整個豬場進行徹底消毒。用2%來蘇兒溶液進行帶豬消毒，5%來蘇兒溶液用于場地、污物、周圍環(huán)境消毒。隔日1次，連用1周。

加強飼養(yǎng)管理工作，驅除蚊、蠅、疥螨、虱等；調整飼養(yǎng)密度，改善飼養(yǎng)環(huán)境，保持豬舍安靜。及時隔離病豬，病死豬作無害化處理。

2 結果與分析

2.1 直接血液壓片鏡檢的結果 光鏡下，可見多數紅細胞表面及周圍附有2～6個附紅細胞體。紅細胞呈淡灰色，附紅細胞體發(fā)出綠色亮光。附紅細胞體多數附著于紅細胞表面單個或成團寄生，呈鏈狀或鱗片狀。少數呈點狀位于紅細胞的邊緣或中央。嚴重感染病例的每個紅細胞上附紅細胞體可達20個以上，此時紅細胞在光鏡下猶如突起的蓖麻球和菠蘿狀。附紅細胞體在血漿中呈游離狀，常做擺動、扭轉、翻滾、上升、下降等運動，一旦附著在紅細胞上以后則停止運動，運動中以個體小者顯得最活潑。若將血液存放于4℃冰箱中，72h內，血漿中的附紅體及菠蘿狀的紅細胞增多，經56℃水浴1min恢復至雙凹狀，血液中游離的附紅細胞體大量增加，運動活潑，有的跳躍，有的做高 速旋轉。如溫度增至60℃時大部分附紅細胞體停止運動，100℃1min全部停止.將含有菠蘿狀紅細胞的血液在4℃冰箱中存放72h后取出，生理鹽水洗滌3次，56℃水浴1min，將此500r／min離心取上清液，再3000r／min離心30min，棄上清取沉渣，見大量活動附紅細胞體。

2.2 姬姆薩染色鏡檢的結果 不同pH值染色液對染色效果的影響，見表1。

表1 不同PH值染色液染色效果

由表1可以看出，在pH值8.0以上的堿性環(huán)境中，姬姆薩染料對附紅細胞體的著色效果較好，附紅細胞體著色較深，并且比較清晰，而在pH值8.0以下的環(huán)境中則著色不好。

染色時間對結果影響：染色6h或12h觀察，整個血片著色不好，18h以上可獲得滿意效果，即鏡下觀察附紅細胞體著色深，輪廓分明。姬姆薩染色后在紅細胞表面上可見到0.5～1.5μm的紫紅色顆粒，呈圓形、逗號狀，每個紅細胞上可出現多個。

2.3 瑞氏染色結果 紅細胞和附紅細胞體均為藍紫色，附紅細胞體著色較深。在星形紅細胞的突出部位或紅細胞表面，可見到圓形深染的顆粒狀物，每個紅細胞上有3～8個不等。

2.4 吖啶橙染色 在熒光顯微鏡下紅細胞為暗淡的綠色，在大多數紅細胞邊緣及表面上可看到一些發(fā)亮熒光的小體，直徑1μm左右，為被吖啶橙染色的附紅細胞體。

2.5 治療結果 3d后，病情逐漸好轉，恢復食欲；5d后，基本采食；7d后，恢復正常，疫情得到控制。

3 討論

3.1 血液壓片相襯觀察法 該方法操作程序簡單，顯微圖像反差強烈，附紅細胞體呈綠色亮光，容易觀察，檢出率高，在附紅細胞體數量較少的情況下，于暗淡的背景中極容易看到發(fā)出綠色亮光的附紅細胞體。缺點是對顯微鏡的性能要求較高，普通顯微鏡和性能欠佳的相襯顯微鏡，其觀察效果常不理想。

3.2 瑞氏、姬姆薩染色法 染色程序簡單，省時省事，染色標本中各種血細胞及附紅細胞體的顯微圖像清晰，容易觀察和判定。染色后的血液涂片如經脫水、封固可長期保存，有利于進行學術交流或作回顧性診斷。缺點是這種染色方法和其他常規(guī)的快速染色法均可產生人為假象（姬姆薩色素沉著），色素會附著在紅細胞上，易被誤認為附紅細胞體。經姬姆薩染色后，有的正常紅細胞邊緣也有著色顆粒，無法與因附著有附紅細胞體的而出現邊緣著染的病變紅細胞明顯區(qū)別，而發(fā)生誤判。在附紅細胞體的數量較少時，還容易造成漏判。盡管如此，如果操作得當，這些染色法，仍不失為一般實驗室進行病原學診斷較為適用的方法。標本以相襯顯微鏡觀察時，顯微圖像反差強烈，在附紅細胞體數量極少的情況下，于暗淡的背景中也極容易看到發(fā)出白色亮光的附紅細胞體，而做出確切的診斷。

3.3 吖啶橙染色法 該方法屬于熒光染色法的一種，吖啶橙可插入DNA和雙鏈RNA的雙螺旋結構內的堿基對之間，此染料是堿性熒光探針可與多核苷酸鏈上的酸性磷酸基團之間借靜電結合。因此，它具有特異性強、檢出率高、不易受紅細胞形態(tài)學變化的影響等特點。即使附紅細胞體的數量較少，以常規(guī)染色法難以做出診斷的血液標本，使用吖啶橙染色時，呈現明亮桔黃色的病原也容易與暗綠色的背景區(qū)別開來，從而做出明確診斷。該方法的不足之處是以熒光染料染色的標本不易保存，難以作回顧性診斷。

4 小結

4.1 通過對病料直接血液壓片和制作血涂片染色鏡檢，結果表明，采集的病料感染了附紅細胞體。

4.2 通過采取緊急免疫接種、藥物防治、嚴格消毒和加強飼養(yǎng)管理等方法，3d后，病情逐漸好轉，恢復食欲；5d后，基本采食；7d后，恢復正常，疫情得到控制。