酶法提取板栗雄花序中黃酮類物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)研究

楊 威，常 虹 ，謝 敏，趙麗芹

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展研究所，北京100097;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

板栗雄花序?yàn)槿|荑花序，所含花粉營養(yǎng)豐富，各種成分配比均衡，板栗花粉中含有黃酮、雌二醇、蛋白質(zhì)、氨基酸、多種礦物質(zhì)元素、脂肪、近百種酶和輔酶及核酸、單糖、多糖等［1］。尤其是板栗花中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)具有抗氧化和清除自由基［2］的作用，其生理功能包括抗癌變［3］、防止動脈硬化、降低血脂和膽固醇，在改善血管通透性及減少冠心病發(fā)病率［4］方面都有良好的效果。其他的功能特性還包括降血糖、調(diào)節(jié)激素和增強(qiáng)機(jī)體的非特異免疫功能和體液免疫功能［5-6］、對于肝臟的保護(hù)、炎癥的祛除以及抗過敏方面亦有良好的功效［7-9］，基于其對人體擁有極佳的保健功能，因此逐漸受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。目前市面上常見的都是從花粉中提取黃酮類物質(zhì)，常用的提取方法有水提法、醇提法［10］等，但無論是在操作的難易程度、提取時(shí)間、提取劑的用量和揮發(fā)上，還是在黃酮類物質(zhì)的提取量上，都不能做到十分令人滿意。本實(shí)驗(yàn)以板栗花雄花序作為實(shí)驗(yàn)原料，采用酶法來提取板栗雄花序中的黃酮類物質(zhì)，為板栗雄花序中黃酮類物質(zhì)的進(jìn)一步研究和今后的加工方式提供理論依據(jù)［11-12］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板栗雄花序 采于北京市農(nóng)林科學(xué)院板栗示范基地，精選花粉充實(shí)、無病蟲害的板栗雄花序;蘆丁 中國藥品生物制品檢定所，分析純;無水乙醇 北京化工廠，化學(xué)純;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 西隴化工廠，均為分析純;纖維素酶和果膠酶(2.4Aua/g)諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。

TU-1901 雙光束紫外可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SY-1000E 多用途恒溫超聲提取機(jī) 北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司;中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平 常熟市衡器廠;酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠;飛鴿牌離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HHS 型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取蘆丁15mg，用60%乙醇完全溶解在100mL 容量瓶中，用60%乙醇定容，搖勻，此時(shí)每1mL 溶液含無水蘆丁0.15mg。準(zhǔn)確量取上述蘆丁溶液1、2、3、4、5mL，分別置于10mL 容量瓶中，然后先加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，再放6min，加4%氫氧化鈉溶液4mL，用60%乙醇稀釋至刻度，在波長510nm 下測其吸光度，然后以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［13］。

1.2.2 酶法提取板栗雄花序中黃酮類物質(zhì) 取陰干放置的板栗雄花序，經(jīng)干燥和粉碎后，加入30mL 濃度為70%的乙醇溶液，在一定的溫度、酶用量等條件下，采用酶法提取，經(jīng)過20min，4000r/min 的離心過濾后，收集提取液，按照測定黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在510nm 下，測定其吸光值，代入回歸方程中，求出提取液中黃酮類化合物的含量，并按照以下公式來計(jì)算板栗雄花序中黃酮類化合物的得率:

1.2.3 超聲波提取板栗雄花序中黃酮類物質(zhì) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用超聲波提取板栗雄花序中的黃酮類物質(zhì)，先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，然后再進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，最后得出超聲波提取的最佳方案為提取溫度65℃，料液比1 ∶135，超聲波功率為300W，提取50min，然后測定提取液的吸光值，計(jì)算得率。

1.2.4 酶法提取板栗雄花序中黃酮類物質(zhì)

1.2.4.1 酶解pH 對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取的影響 稱取板栗花花粉1g，在復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶=1∶1)用量1.0%(E/S)，酶解溫度為50℃條件下，酶解1h，酶解pH 選擇3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，研究酶解pH 對板栗花黃酮提取效果的影響。

1.2.4.2 加復(fù)合酶量(纖維素酶∶果膠酶=1∶1［12］)對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取的影響 稱取板栗花粉1g，酶解溫度為50℃條件下，酶解1h，酶解pH 為4.0，復(fù)合酶量選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%(E/S)，研究復(fù)合酶量對板栗花黃酮提取效果的影響。

1.2.4.3 酶解溫度對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取的影響 稱取板栗花花粉1g，復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶=1∶1)用量0.8%(E/S)，酶解pH 為4.0，酶解1h，酶解溫度選擇35、40、45、50、55℃，研究酶解溫度對板栗花黃酮提取效果的影響。

1.2.4.4 酶解時(shí)間對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取的影響 稱取板栗花花粉1g，復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶=1∶1)用量0.8%(E/S)，酶解溫度為40℃，酶解pH 為4.0，酶解時(shí)間選擇30、60、90、120、150min，研究酶解pH 對板栗花黃酮提取效果的影響。

1.2.4.5 酶法輔助提取板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)溫度、酶用量、pH、時(shí)間四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)水平表見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類物質(zhì)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色測得蘆丁濃度與吸光值的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

以蘆丁質(zhì)量濃度C(mg/mL)對吸光度A 做線性回歸，得方程為:y =1.689x-0.0253，R2=0.9999。

2.2 酶法對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取效果的影響

2.2.1 酶解pH 對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取效果的影響 由圖2 可知，當(dāng)pH 為4.0 時(shí)，板栗雄花序黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大5.2%，當(dāng)pH 大于4.0 以后，板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的提取量呈大幅下降趨勢，當(dāng)pH 為5.5 時(shí)，板栗雄花序黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最小值3.85%。這是因?yàn)槊傅幕钚允躳H 影響較大，當(dāng)pH 為4.0 時(shí)，復(fù)合酶發(fā)揮最大活力，破壞細(xì)胞壁，降低傳質(zhì)阻力，使得黃酮類物質(zhì)的溶出效率也達(dá)到最大值，當(dāng)pH 大于4.0 時(shí)超出了酶的最佳活力范圍，所以板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的提取量就會降低。因此，酶法輔助提取板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的最佳pH 為4.0。

圖2 酶解pH 對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取效果的影響Fig.2 The effect of pH on the extraction of flavonoids from chestnut male inflorescence

2.2.2 加復(fù)合酶量對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取效果的影響 由圖3 可知，隨著復(fù)合酶用量的增大，酶與底物作用的機(jī)會逐漸增多，酶的催化效率亦逐漸升高，當(dāng)復(fù)合酶用量增大到0.8%時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大值4.73%。繼續(xù)添加復(fù)合酶用量，黃酮類物質(zhì)的提取量卻略有下降，可能的原因是酶量過高，底物濃度不能對酶達(dá)到飽和，致使酶的作用受到抑制。因此，本實(shí)驗(yàn)選用0.8%為酶的最佳添加量。

2.2.3 酶解溫度對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取效果的影響 由圖4 可知，當(dāng)酶解溫度為40℃時(shí)，板栗雄花序黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大值5.44%，當(dāng)酶解溫度大于40℃以后，板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的提取量呈下降趨勢，當(dāng)酶解溫度為55℃時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最低4.53%。這可能是因?yàn)槊冈?0℃左右活性最強(qiáng)，當(dāng)酶解溫度較低時(shí)，酶活力低;當(dāng)酶解溫度超過40℃時(shí)，酶蛋白質(zhì)變性，酶活力減弱甚至喪失活性。因此酶法輔助提取板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的最適溫度為40℃。

圖3 加酶量對板栗雄花序黃酮提取效果的影響Fig.3 The effect of the concentration of enzyme on the extraction of flavonoids from chestnut male inflorescence

圖4 酶解溫度對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取效果的影響Fig.4 The effect of the temperature of enzymatic hydrolysis on the extraction of flavonoids from chestnut male inflorescence

2.2.4 酶解時(shí)間對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取效果的影響 由圖5 可知，當(dāng)酶解時(shí)間為60min 時(shí)，板栗花黃酮類物質(zhì)的得率達(dá)到最大5.3%，當(dāng)酶解時(shí)間超過60min 以后，板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的提取量呈大幅下降趨勢，當(dāng)酶解時(shí)間為150min 時(shí)，板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的得率達(dá)到最小4.53%。這是因?yàn)檫^長的時(shí)間可能會導(dǎo)致酶失活，而且酶解太長時(shí)間可能會引起黃酮化合物結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致總黃酮含量降低。因此酶法輔助提取板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的最佳時(shí)間為60min。

圖5 酶解時(shí)間對板栗雄花序黃酮類物質(zhì)提取效果的影響Fig.5 The effect of the time of enzymatic hydrolysis on the extraction of flavonoids from chestnut male inflorescence

2.2.5 酶法輔助提取板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的正交實(shí)驗(yàn) 從表2 可以得出，影響板栗雄花序中黃酮類物質(zhì)得率的主次順序?yàn)锽 ＞D ＞A ＞C，即酶用量＞時(shí)間＞溫度＞pH。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出在A2B3C1D1的工藝條件下黃酮類物質(zhì)的得率為5.2%，高于工藝條件A2B3C1D2下黃酮類物質(zhì)得率5.1%。因此酶法提取黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件為溫度40℃，復(fù)合酶用量0.9%，pH3.75，提取時(shí)間為45min，黃酮類物質(zhì)的得率為5.2%。

表2 酶法提取板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The result by orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis for flavonoids from chestnut male inflorescence

2.3 酶法提取和超聲波提取方法的比較

由表3 可知，超聲波法提取得率為4.6%，而酶法提取得率為5.2%，酶法要比超聲波提取法得率高出6%，而且無論從提取時(shí)間上，料液的使用上，還是能量的消耗上，酶法與超聲波法相比都具有一定的優(yōu)勢。

表3 酶法與超聲波法提取方法的比較Table 3 The comparison between enzymatic hydrolysis and ultrasonic extraction

3 結(jié)論

在板栗雄花序黃酮類物質(zhì)的提取上選用酶法提取，酶法提取復(fù)合酶用量＞時(shí)間＞溫度＞pH。最佳提取條件為:溫度40℃，復(fù)合酶用量0.9%，pH3.75，提取時(shí)間為45min，在此條件下，黃酮類物質(zhì)提取的得率為5.2%。酶法比超聲波法提取板栗雄花序黃酮類物質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢，還具有節(jié)省料液，降低能量損耗和提取方法溫和的特點(diǎn)。

［1］李英華，胡福良.我國花粉化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.養(yǎng)蜂科技，2005(4):7-16.

［2］向麗，周青，葉亞新，等.La(Ⅲ)對UV-B 輻射脅迫下大豆幼苗類黃酮清除自由基影響［J］.稀土，2009，30(2):86-88.

［3］Kawa Guchik，Mizuno TAdak，et al.Hesperidin as aninhibitor of lipases from porcine pancreas and Pseudomonas［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1997，61(1):102-104.

［4］Steinberg F M，Guthrie N L，Villablanca A C，et al.Soy protein with isoflavones has favorable effects on endothelial function that are independent of lipid and antioxidant effects in healthy postmenopausal women［J］.Am J Clin Nutr，2003，78(1):123-130.

［5］耿敬章，馮君琪.黃酮類化合物的生理功能與應(yīng)用研究［J］.中國食品添加劑，2007(7):62-65.

［6］曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2003，23(12):2241-2247.

［7］崔治中，崔保安.獸醫(yī)免疫學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

［8］王超云.黃芩苷對化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中草藥，2005，36(5):730-732.

［9］白鳳梅，蔡同一.類黃酮生物活性及其機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，1999(8):11-13.

［10］邊嘯林，李政，王廣正，等.乙醇浸提法提取黑穗醋栗果實(shí)中黃酮類物質(zhì)的研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009(11):24-25.

［11］Shuo Chen，Xin-Hui Xing.Enzyme-assisted extraction of flavonoids from Ginkgo biloba leaves:Improvement effect of flavonol transglycosylation catalyzed by penicillium decumbens cellulose［J］. Enzyme and Microbial Technology，2011，48:100-105.

［12］章斌，侯小楨.復(fù)合酶法提取廣佛手總黃酮的工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2010(10):188-192.

［13］馬宏峰，高麗梅，趙光云，等.比色法測定板栗花中總黃酮的含量［J］.中國現(xiàn)代中藥，2010，12(10):25-28.