高溫紫鏈霉菌酸性耐熱幾丁質(zhì)酶的純化及性質(zhì)研究

楊紹青，張舒平，閆巧娟，劉竹青，江正強，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京100083;3.中國農(nóng)業(yè)大學水利與土木工程學院，北京100083)

幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)是一類重要的糖苷鍵水解酶，能夠催化幾丁質(zhì)水解產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖單體或低分子量幾丁寡糖［1］。近年來，幾丁質(zhì)酶由于在制備幾丁寡糖、處理海洋廢棄物以及農(nóng)業(yè)生物防治等方面具有巨大的應用潛力而備受關(guān)注。目前幾丁質(zhì)酶已被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料、環(huán)保以及能源等領域。幾丁質(zhì)酶廣泛存在于細菌、鏈霉菌、真菌、植物、昆蟲甚至脊椎動物中［1-2］。微生物來源的幾丁質(zhì)酶由于具有生產(chǎn)速度快、產(chǎn)量高、性能穩(wěn)定等優(yōu)點，目前已成為幾丁質(zhì)酶的主要來源。迄今，已有許多關(guān)于不同微生物來源幾丁質(zhì)酶的純化及性質(zhì)的研究報道，其中以鏈霉菌來源為主，主要有灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、深藍紫鏈霉菌(Streptomyces cyaneus)、弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、紅色鏈霉菌(Streptomyces erythraeus ) 以 及 紫 黑 鏈 霉 菌(Streptomyces violaceusniger)等［2-4］。耐熱幾丁質(zhì)酶具有熱穩(wěn)定性好、可在高溫下反應從而加快反應速度、高溫條件可減少環(huán)境微生物污染等優(yōu)點，因此，相較中溫酶而言更適合于工業(yè)化生產(chǎn)和應用。目前關(guān)于嗜熱菌耐熱幾丁質(zhì)酶的研究主要集中于部分嗜熱古菌、嗜熱細菌及嗜熱真菌［5-6］，關(guān)于嗜熱鏈霉菌耐熱幾丁質(zhì)酶的研究報道相對較少。Tsujibo 等［7］從高溫紫鏈霉菌OPC-520 發(fā)酵液中純化得到一種分子量為40ku 的幾丁質(zhì)酶，最適溫度和pH 分別為80℃和9.0。Christodoulou 等［8］進一步克隆了高溫紫鏈霉菌OPC-520 的幾丁質(zhì)酶基因chit40，并進行了高效表達，得到分子量為40ku 的重組幾丁質(zhì)酶，該酶的最適溫度和pH 分別為60℃和6.0。目前，還沒有關(guān)于高溫紫鏈霉菌酸性幾丁質(zhì)酶純化和性質(zhì)的研究報道。實驗室前期從土壤樣品中篩選得到一株能夠產(chǎn)耐熱幾丁質(zhì)酶的嗜熱鏈霉菌Z16，鑒定其為高溫紫鏈霉菌。本研究進一步對該菌所產(chǎn)耐熱幾丁質(zhì)酶進行分離純化，并研究其酶學性質(zhì)及對膠體幾丁質(zhì)的水解特性，為其今后工業(yè)化生產(chǎn)和應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

離子交換層析柱料DEAE-52、凝膠層析柱料Superdex-75 GE Healthcare 公司;幾丁質(zhì)、羧甲基纖維素(CMC) 美國Sigma 公司;乙二醇殼聚糖、乙二醇幾丁質(zhì) 日本W(wǎng)ako 公司;幾丁寡糖 中科院微生物所金城教授;低分子量標準蛋白 大連寶生物工程有限公司;其它試劑 若無特殊說明均為分析純。

TU-1800PC 紫外可見分光光度計 北京普析通用有限公司;蛋白純化系統(tǒng) 上海青浦滬西儀器廠;硅膠板60F254德國Merck 公司;GL-20B 冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 菌株及發(fā)酵產(chǎn)酶

菌株:高溫紫鏈霉菌Z16 由實驗室篩選并保存。菌株在膠體幾丁質(zhì)平板上50℃培養(yǎng)3～4d 后保存于4℃條件下，每6～7 周轉(zhuǎn)接1 次。平板培養(yǎng)基組成為(g/L):膠體幾丁質(zhì)5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.7，F(xiàn)eSO40.1，瓊脂15，pH值自然。

發(fā)酵產(chǎn)酶:首先將1 ～2 環(huán)菌種由平板接入到50mL 種 子 培 養(yǎng) 基 中(250mL 三 角 瓶)，50℃，200r/min振蕩培養(yǎng)18h，即為發(fā)酵種子液。然后按5%的接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，45℃，200r/min 振蕩培養(yǎng)60h。發(fā)酵液于4℃下9720 ×g 離心10min，上清液即為幾丁質(zhì)酶粗酶液。

種子培養(yǎng)基組成為(g/L):粉末幾丁質(zhì)10，酵母浸粉5，蛋白胨5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.7，F(xiàn)eSO40.01 和ZnSO40.01，pH 自然。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):膠體幾丁質(zhì)5，粉末幾丁質(zhì)10，酵母浸粉1.25，黃豆粉3.75，吐溫20 4，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.7，F(xiàn)eSO40.01 和ZnSO40.01，pH 自然。

1.3 酶活力及蛋白含量測定

采用DNS 法測定幾丁質(zhì)酶酶活力。取100μL 膠體幾丁質(zhì)溶液(1%)于1.5mL 離心管中，50℃水浴預熱10min，然后向離心管中加入100μL 適當稀釋的酶液。50℃反應30min 后加入300μLDNS 試劑終止反應，最后煮沸10min 顯色。待反應體系溶液冷卻至室溫后加入250μL 的去離子水，9720 ×g 離心5min，取上清液于540nm 下測吸光度值。酶活力單位(U)定義為:在上述反應條件下每分鐘釋放1μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量，以N-乙酰氨基葡萄糖為標準。

蛋白含量的測定采用Lowry 法［9］，以牛血清蛋白作為標準。

1.4 幾丁質(zhì)酶的純化

首先向粗酶液中緩慢加入40%～80%飽和度的硫酸銨，酶液在4℃下緩慢攪拌30min 后于9720 ×g下冷凍離心10min，收集沉淀，用20mmol/L pH7.0 的磷酸緩沖液溶解沉淀，沉淀溶液在相同的緩沖液中4℃下透析過夜。然后將透析后的蛋白樣品以1mL/min的流速上樣到預先用20mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)平衡好的DEAE-52 陰離子交換層析柱中。先用平衡緩沖液以相同的流速洗脫未結(jié)合的雜蛋白直至OD280小于0.05，接著用0.5 ～1.0mol/L 梯度的NaCl 溶液(用pH7.0，20mmol/L PB 緩沖液配制)線性洗脫，收集洗脫部分，測定酶活力，SDS-PAGE 檢測酶純度。

1.5 SDS-PAGE 及分子量測定

SDS-PAGE 按Laemmli 等［10］方法進行，分離膠濃度為12.5%(w/v)，濃縮膠濃度為4.5%(w/v)。考馬斯亮藍R-250 染色顯示蛋白帶。依據(jù)標準蛋白及待測純酶在SDS 凝膠上的相對遷移率來計算純酶在變性條件下的分子量。幾丁質(zhì)酶活性狀態(tài)下分子量采用凝膠過濾法測定:將純酶樣品和標準蛋白分別以相同的條件過Superdex-75(1.0cm ×40cm)凝膠柱。采用20mmol/L 檸檬酸緩沖溶液(pH6.0)為洗脫液，洗脫流速0.33mL/min。

1.6 幾丁質(zhì)酶的最適pH 與最適溫度及pH 與溫度穩(wěn)定性

在不同的pH 條件下測定酶活力以確定酶的最適反應pH。不同緩沖液體系分別為50mmol/L 檸檬酸緩沖溶液(pH3.0 ～6.0)、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.0～6.0)、MES 緩沖液(pH5.5～6.5)、磷酸緩沖溶液(pH6.0～8.0)、CHES(pH8.0～10.0)、CAPS (pH10.0～11.0)和Na2HPO4-NaOH 緩沖液(pH11.0 ～12.0)。幾丁質(zhì)酶的pH 穩(wěn)定性測定:將酶液在上述不同緩沖液中50℃下處理30min 后按照標準的方法測定殘余酶活力。

幾丁質(zhì)酶的最適溫度測定:分別在30～90℃下測定酶活力，酶活力最高點即為幾丁質(zhì)酶的最適反應溫度。溫度穩(wěn)定性:將純酶分別在30 ～90℃下保溫30min，然后在50℃下測定殘余酶活，以未保溫(稀釋相同倍數(shù)后，4℃處理)的酶活力作為100%。幾丁質(zhì)酶的半衰期測定:將酶液在55、60、65、70℃下分別保溫300min，間隔取樣，測定殘余酶活力，以ln(相對殘余酶活力)與處理時間作圖，然后計算半衰期。

1.7 幾丁質(zhì)酶的底物特異性

分別以1% (w/v)的膠體幾丁質(zhì)、乙二醇幾丁質(zhì)、殼聚糖溶液、乙二醇殼聚糖、CMC、樺木木聚糖、刺槐豆膠、海帶多糖及可溶性淀粉(溶解于50mmol/L pH4.0 緩沖液中)作為反應底物，50℃下分別反應10min 測定幾丁質(zhì)酶的酶活力。

1.8 幾丁質(zhì)酶的水解特性及產(chǎn)物分析

在1%的膠體幾丁質(zhì)溶液中加入1U/mL 的幾丁質(zhì)酶，混勻后置于50℃水浴中反應，在不同的時間點取樣，樣品于沸水中滅活5min 后采用TLC 法分析水解產(chǎn)物。展層體系為正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1(v∶v∶v)。顯色參考Kopparapu 等［11］的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶的分離純化

高溫紫鏈霉菌Z16 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀和DEAE-52 弱陰離子交換層析兩步純化后得到電泳級純酶(圖1)。純化過程酶活力回收率為22.3%，純化倍數(shù)為12.7，比酶活力由2.9U/mg 提高到36.8U/mg(表1)。SDS-PAGE 法和凝膠過濾法測測定幾丁質(zhì)酶的分子量分別為41.6ku(圖1)和40.8ku，說明該幾丁質(zhì)酶為單亞基蛋白。

表1 高溫紫鏈霉菌Z16 幾丁質(zhì)酶的純化Table 1 Purification of the a chitinase from the culture broth of S.thermoviolaceus Z16

不同微生物來源的幾丁質(zhì)酶分子量差異較大，大多處于20～120ku 之間［12］。通常，細菌來源的幾丁質(zhì)酶分子量較大(60～110ku)，真菌幾丁質(zhì)酶分子量相對較小(30～60ku)，而放線菌來源的幾丁質(zhì)酶一般在30～40ku 左右［13］。本研究中的幾丁質(zhì)酶分子量與來源于高溫紫鏈霉菌OPC-520［7］和淺玫瑰色鏈霉菌GH-18 的40ku 幾丁質(zhì)酶較為接近［14］，但高于其它鏈霉菌如Streptomyces sp.M-20、Streptomyces sp. DA11和Streptomyces anulatus 等［3-4，15］幾丁質(zhì)酶的分子量。

圖1 高溫紫鏈霉菌Z16 幾丁質(zhì)酶的純化電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of the proteins during the purification process of a chitinase from S.thermoviolaceus Z16

2.2 幾丁質(zhì)酶的最適pH 及pH 穩(wěn)定性

在不同的pH 條件下測定幾丁質(zhì)酶的酶活力，結(jié)果表明該酶的最適反應pH 為pH4.0(檸檬酸緩沖液)，在處于pH3.0～6.0 的酸性條件下保持較高的酶活力，當pH ＞6.0 時，酶活力開始快速下降(圖2A)，說明該酶是一種酸性幾丁質(zhì)酶。該幾丁質(zhì)酶酶在pH3.0～11.5 的不同緩沖液中處理30min 后殘余酶活力仍保存在80%以上(圖2B)，說明該酶具有很強的pH 穩(wěn)定性和很寬的pH 穩(wěn)定范圍。

圖2 幾丁質(zhì)酶的最適反應pH (A)及pH 穩(wěn)定性(B)Fig.2 Optimal pH(A)and pH stability(B)of the purified chitinase

雖然微生物幾丁質(zhì)酶的最適pH 差別較大，分布于3.0 至11.0 之間，但絕大多數(shù)放線菌幾丁質(zhì)酶的最適pH 都處于偏酸性環(huán)境(pH4.0～6.0)。高溫紫鏈霉菌Z16 幾丁質(zhì)酶的最適pH 為4.0，與來源于其它鏈霉菌的幾丁質(zhì)酶最適pH 接近，如來源于Strptomyces coelicolor A3 的幾丁質(zhì)酶(pH4.0)［16］，但明顯比同一種屬菌株高溫紫鏈霉菌OPC-520 來源的幾丁質(zhì)酶的最適pH9.0 低［17］，說明兩者性質(zhì)存在很大差別，并不是同一種幾丁質(zhì)酶。

2.3 幾丁質(zhì)酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

幾丁質(zhì)酶的最適反應溫度為60℃(圖3A)，當溫度處于50～70℃之間時，幾丁質(zhì)酶具有較高的酶活力(＞60%)，而當溫度低于50℃或高于70℃時，酶活力迅速下降(圖3A)。溫度穩(wěn)定性測定結(jié)果表明該幾丁質(zhì)酶具有很好的溫度穩(wěn)定性，60℃下保溫30min 后殘余酶活力仍保持在80%以上(圖3B)，當溫度繼續(xù)升高到65℃以上時，殘余酶活力開始急劇下降至25%以下(圖3B)。進一步測定該酶在不同溫度下的半衰期，結(jié)果表明該酶在55℃和60℃時具有很好的溫度穩(wěn)定性，半衰期分別為267min 和132.9min(圖3C)，而當溫度提高至65℃和70℃時，該酶的半衰期快速降至16.6min 和13.4min(圖3C)。

通常，高溫酶相較于中溫酶來說具有許多獨特的優(yōu)勢，如不易變性、便于儲藏、反應速度快、效率高、不易受污染等，因此實際應用的適應性更強。高溫紫鏈霉菌Z16 幾丁質(zhì)酶的最適溫度為60℃，比Tsujibo 等［17］報道的高溫紫鏈霉菌來源的幾丁質(zhì)酶最適溫度低(80℃)，與來自高溫紫鏈霉菌OPC-520 野生型幾丁質(zhì)酶一致(60℃)［8］，但明顯高于其它鏈霉菌來源的幾丁質(zhì)酶，如紫黑鏈霉菌(28℃)［18］、中溫鏈霉菌RC1071(40℃)［19］、海洋鏈霉菌DA11(40℃)［4］和灰色鏈霉菌HUT7037(55℃)［2］等。

2.4 幾丁質(zhì)酶的底物特異性及水解特性

圖3 幾丁質(zhì)酶的最適反應溫度(A)、穩(wěn)定穩(wěn)定性(B)和半衰期(C)Fig.3 Optimal temperature (A)，thermostablity (B)and thermal denaturing time (C)of a chitinase from S.thermoviolaceus Z16

幾丁質(zhì)酶的底物特異性見表2。該酶具有嚴格的底物特異性，對膠體幾丁質(zhì)表現(xiàn)出了最強的水解作用，比酶活力達到36.8U/mg，對乙二醇幾丁質(zhì)、CMC 及殼聚糖溶液只有輕微的水解能力，比酶活力分別僅為3.0、0.6、0.32U/mg，而對乙二醇殼聚糖、刺槐豆膠、海帶多糖、樺木木聚糖和可溶性淀粉等其它底物沒有水解能力。

表2 幾丁質(zhì)酶的底物特異性Table 2 Substrate specificity of the purified chitinase

在1%濃度的膠體幾丁質(zhì)溶液中加入1U/mL 的幾丁質(zhì)酶，50℃進行水解反應以考察幾丁質(zhì)酶對膠體幾丁質(zhì)的水解特性。結(jié)果表明該幾丁質(zhì)酶能夠高效降解膠體幾丁質(zhì)，降解產(chǎn)物主要為N-乙酰氨基葡萄糖和幾丁二糖，其次還有少量的幾丁三糖生成(圖4)。根據(jù)該酶水解產(chǎn)物的組成，可判定其為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶。本研究中的幾丁質(zhì)酶顯示出嚴格的底物特異性，僅對膠體幾丁質(zhì)溶液有很強的水解活性，對乙二醇幾丁質(zhì)、CMC 及殼聚糖溶液只有輕微的水解能力，而對其它底物則沒有水解能力。這一特性與來源于Streptomyces sp.M-20 的幾丁質(zhì)酶比較接近［3］，但是與灰色鏈霉菌HUT7037 來源的幾丁質(zhì)酶差別較大，后者具有較寬的底物特異性范圍，不僅能夠水解膠體幾丁質(zhì)，而且還能夠水解乙二醇幾丁質(zhì)、羧甲基幾丁質(zhì)以及脫乙酰幾丁質(zhì)等幾丁質(zhì)類化合物［2］。嚴格的底物特異性使本研究中的酸性耐熱幾丁質(zhì)酶適合應用于幾丁質(zhì)資源的高效降解、生物轉(zhuǎn)化等領域。

3 結(jié)論

從高溫紫鏈霉菌Z16 發(fā)酵液中純化得到一種幾丁質(zhì)酶。該酶為單亞基蛋白，SDS-PAGE 和凝膠過濾測得分子量分別為41.6ku 和40.8ku。該酶的最適反應pH 和最適反應溫度分別為pH4.0 和60℃，且該酶在pH3.0～6.0 時保持較高的酶活力，同時，該酶在55℃和60℃的半衰期分別為267min 和132.9min，表明該酶為一種酸性的耐熱酶。該酶能夠?qū)⒛z體幾丁質(zhì)水解成N-乙酰氨基葡萄糖、幾丁二糖以和少量的幾丁三糖。高溫紫鏈霉菌Z16 這些優(yōu)良的酶學特性使其具有重要的應用價值和廣闊的應用前景。

［1］Bhattacharya D，Nagpure A，Gupta R K.Bacterial chitinases:properties and potential［J］.Crit Rev Biotechnol，2007，27(1):21-28.

［2］Mitsutomi M，Hata T，Kuwahara T. Purification and characterization of novel chitinases from Streptomyces griseus HUT6037［J］.J Ferment Bioeng，1995，80:153-158.

［3］Kim KJ，Yang YJ，Kim JG.Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp.M-20［J］.J Biochem Mol Biol，2003，36(2):185-189.

［4］Han Y，Yang B，Zhang F，et al.Characterization of antifungal chitinase from marine Streptomyces sp.DA11 associated with South China Sea sponge Craniella australiensis［J］.Mar Biotechnol，2009，11(1):132-140.

［5］Tanaka T，F(xiàn)ujiwara S，Nishikori S，et al.A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65(12):5338-5344.

［6］郭潤芳，史小琴，李多川，等.一種耐熱幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生及其穩(wěn)定性研究［J］.微生物學通報，2008(4):481-485.

［7］Tsujibo H，Hatano N，Endo H，et al. Purification and characterization of a thermostable chitinase from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 and cloning of the encoding gene［J］.Bio Biotechnol Biochem，2000，64(1):96-102.

［8］Christodoulou E，Duffner F，Vorgias C E.Overexpression，purification，and characterization of a thermostable chitinase(Chi40)from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520［J］.Protein Express Purif，2001，23(1):97-105.

［9］Lowry O H，Rosebrough N J，L F A，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.J Biol Chem，1951，193(1):265-275.

［10］Laemmli U K，Molbert E，Showe M，et al.Form-determining function of the genes required for the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.J Mol Biol，1970，49(1):99-113.

［11］Kopparapu N K，Liu Z Q，Yan Q J，et al. A novel thermostable chitinase (PJC) from pomegranate (Punica granatum)juice［J］.Food Chem，2011，127:1569-1575.

［12］余長纓，韓寶芹，李靜，等.海洋弧菌幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)酶條件及分離純化研究［J］.高技術(shù)通訊，2002(9):70-73.

［13］王偉霞，李福后.微生物幾丁質(zhì)酶的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，32:10196-10198.

［14］Jiang X Y，Chen D C，Hong S L，et al.Identification，characterization and functional analysis of a GH-18 chitinase from Streptomyces roseolus［J］.Carbohydr Polymer，2011，87(4):2409-2415.

［15］Aly M M，Tork S，Al- Garni S M.Chitinolytic enzyme production and genetic improvement of a new isolate belonging to Streptomyces anulatus［J］.Ann Microbiol，2011，61(3):453-461.

［16］Kawase T，Yokokawa S，Saito A，et al. Comparison of enzymatic and antifungal properties between family 18 and 19 chitinases from S.coelicolor A3(2)［J］.Bio Biotechnol Biochem，2006，70(4):988-998.

［17］Tsujibo H，Endo H，Minoura K，et al.Cloning and sequence analysis of the gene encoding a thermostable chitinase from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520［J］.Gene，1993，134(1):113-117.

［18］Shekhar N，Bhattacharya D，Kumar D，et al.Biocontrol of wood-rotting fungi with Streptomyces violaceusniger XL-2［J］.Can J Microbiol，2006，52(9):805-808.

［19］Gomes R C，Semedo L T，Soares R M，et al.Purification of a thermostable endochitinase from Streptomyces RC1071 isolated from a cerrado soil and its antagonism against phytopathogenic fungi［J］.J Appl Microbiol，2001，90(4):653-661.