多塞平對(duì)骨癌疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用研究

姚 旌，王 林，陸 魏（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院疼痛診療中心，貴陽(yáng) 550004）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的資料，癌癥的發(fā)病人數(shù)在2007年已經(jīng)達(dá)到1.15億，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)到1.55億，其中30%～50%的患者將會(huì)經(jīng)歷疼痛，雖然根據(jù)世界衛(wèi)生組織“階梯療法”使用嗎啡、糖皮質(zhì)激素以及解熱鎮(zhèn)痛藥治療可以使90%的患者減輕痛苦，但是嗎啡會(huì)產(chǎn)生耐受以及成癮[1]，所以尋找治療癌痛的高效、低副作用的藥物是目前研究熱點(diǎn)。三環(huán)類抗抑郁藥從20世紀(jì)60年代開始一直用于抑郁癥的治療，其作用機(jī)制為阻滯去甲腎上腺素和血清素的再攝取，從而增加了這些神經(jīng)遞質(zhì)的濃度以便于其相應(yīng)的突觸后受體結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)[2]。目前，三環(huán)類抗抑郁藥如多塞平，已發(fā)現(xiàn)其對(duì)于急性及慢性疼痛均具有鎮(zhèn)痛作用，如術(shù)后疼痛、腰痛、神經(jīng)源性疼痛等；且其鎮(zhèn)痛作用的劑量明顯低于抗抑郁作用[3]。有報(bào)道[4]頭頸部放療后產(chǎn)生口腔黏膜炎的患者在使用多塞平洗劑漱口以后不僅改善了口腔黏膜炎的癥狀，還產(chǎn)生了鎮(zhèn)痛作用。所以筆者研究了多塞平對(duì)骨癌疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用，以期為其使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子測(cè)痛儀（意大利Ugo Basile公司）；細(xì)胞操作超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

多塞平原料藥（福達(dá)化工有限公司，批號(hào)：101109，純度：99.99%）；戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：090306，規(guī)格：每瓶5 g）；無(wú)菌骨蠟（北方三友醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：100223110）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：09100229）。

1.3 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人乳腺癌Walker256細(xì)胞株，上海艾研生物科技有限公司提供，一直凍存于液氮罐中。SD大鼠，90只，體重150～170 g，♀；SD幼年大鼠1只，體重70 g，♀，均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2008-0003。

2 方法

2.1 劑量設(shè)定

Wordliczek等[5]進(jìn)行了鞘內(nèi)注射多塞平治療大鼠福爾馬林誘發(fā)疼痛的研究，研究結(jié)果表明多塞平的最大有效劑量為1 000μg·kg－1，所以筆者根據(jù)其結(jié)果，選定多塞平的最高劑量為1 000μg·kg－1，陽(yáng)性藥物嗎啡的劑量則設(shè)定為與其最高劑量相同的1 000 μg·kg－1。根據(jù)Gong等[6]的量效曲線關(guān)系劑量設(shè)定原則，設(shè)定了從最高劑量1 000μg·kg－1以下5個(gè)劑量，即多塞平3、10、30、100、300、1 000 μg·kg－1，來(lái)繪制量效曲線，計(jì)算其最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)（Emax）以及半數(shù)有效量（ED50）。

2.2 細(xì)胞的制備

取出Walker256細(xì)胞凍存管，放入37℃燒杯中快速解凍。吸出細(xì)胞懸液，加無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）使細(xì)胞懸浮，1 500 r·m in－1離心3m in，棄上清，重復(fù)漂洗1次，加適量無(wú)菌PBS，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為107個(gè)/m L。取幼年大鼠1只，抽0.5m L Walker 256細(xì)胞接種于其腹腔中。7 d后待幼鼠出現(xiàn)腹水癥時(shí)，抽取含腫瘤細(xì)胞的腹水，將收集到的腹水1 500 r·min－1離心3m in，棄上清，用無(wú)菌PBS沖洗后再以1 500 r·m in－1離心3 min，然后用無(wú)菌PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)/μL，備用。

2.3 骨癌疼痛模型的建立

取大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg·kg－1）麻醉，消毒其左側(cè)脛骨下1/3皮膚，切開皮膚，分離肌肉，暴露脛骨骨面。用滅菌7號(hào)針頭垂直于骨表面鉆孔后，用50μL微量進(jìn)樣器深刺入骨髓腔，緩慢注入10μL“2.2”項(xiàng)下制備的含Walker256的大鼠細(xì)胞液，用無(wú)菌骨蠟封孔并逐層消毒縫合，整個(gè)手術(shù)過(guò)程和相關(guān)手術(shù)器械均嚴(yán)格按照無(wú)菌手術(shù)要求執(zhí)行[7]。

2.4 模型的檢測(cè)

待造模后，將大鼠置于網(wǎng)格架臺(tái)上，適應(yīng)環(huán)境30m in，使用電子測(cè)痛儀測(cè)量造模同側(cè)腳以及造模對(duì)側(cè)腳刺激后腳抬起的閾值，作為大鼠的痛閾值，單位為g，當(dāng)造模同側(cè)腳痛閾值＜5 g即為造模成功。

2.5 蛛網(wǎng)膜下腔插管方法

大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，背部剪毛、消毒，從髂骨正中向上下分別劃開皮膚1 cm，用不銹鋼套管（內(nèi)套PE-10導(dǎo)管）在L4和L5之間垂直刺入椎管，此時(shí)大鼠的尾巴或后肢會(huì)出現(xiàn)輕微抽動(dòng)，改變不銹鋼管的方向，將套管尖端指向大鼠頭端送入脊髓蛛網(wǎng)膜下腔至腰膨大水平，拔套管，縫合局部組織以固定管，頸部皮膚剪小口，PE管經(jīng)皮下由此穿出，縫合頸部局部皮膚組織，固定，術(shù)后單籠飼養(yǎng)[6]。

2.6 鎮(zhèn)痛作用研究

取90只大鼠分為正常組、模型組、嗎啡（1 000 μg·kg－1）和多塞平3、10、30、100、300、1 000 μg·kg－1劑量組，每組10只，除正常組10只外均需造模。于造模后1、5、10、15、20、25、30 d測(cè)定各組大鼠兩側(cè)足底的痛閾值。待第30天模型穩(wěn)定后，行蛛網(wǎng)膜下腔插管。到第31天，使用電子測(cè)痛儀測(cè)量造模同側(cè)腳以及造模對(duì)側(cè)腳的基礎(chǔ)痛閾值，記錄為基礎(chǔ)值，然后各組大鼠經(jīng)導(dǎo)管單次鞘內(nèi)注射相應(yīng)劑量藥物，正常組及模型組給予等容量生理鹽水，分別于給藥后0.5、1、2、4 h測(cè)量各組大鼠兩側(cè)足底的痛閾值。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算出Emax和ED50，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)行t檢驗(yàn)。Emax＝（同側(cè)藥后痛閾值－同側(cè)基礎(chǔ)值）/（對(duì)側(cè)藥后痛閾值－對(duì)側(cè)基礎(chǔ)值）×100%。

3 結(jié)果

3.1 建模情況

大鼠脛骨注入Walker256細(xì)胞以后，痛閾值開始隨時(shí)間變化逐漸降低，到第10天顯著下降，到第15天左右下降到最低水平，當(dāng)經(jīng)過(guò)30 d以后，模型基本穩(wěn)定，但造模對(duì)側(cè)腳的痛閾值一直無(wú)明顯變化。大鼠造模后兩側(cè)腳痛閾值變化見圖1。

圖1 大鼠建模后兩側(cè)腳痛閾值變化Fig 1 Changesof pain thresholdsof bilateral footaftermodeling

3.2 鎮(zhèn)痛作用

多塞平各劑量與嗎啡在給藥后0.5 h即產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，給藥后1 h鎮(zhèn)痛作用達(dá)到高峰。多塞平各劑量組大鼠造模對(duì)側(cè)腳痛閾值無(wú)明顯變化，造模同側(cè)腳痛閾值升高與劑量呈正相關(guān)。多塞平1 000μg·kg－1劑量組在給藥后4 h時(shí)依然存在鎮(zhèn)痛效應(yīng)。根據(jù)結(jié)果繪制量效曲線，得出多塞平鞘內(nèi)注射治療骨癌疼痛的ED50為46.6 μg·kg－1，其1 000 μg·kg－1時(shí)的Emax約為67.7%，與嗎啡1 000μg·kg－1的最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)78.6%比較無(wú)明顯差異，具體結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

圖2 各組大鼠給藥后對(duì)側(cè)腳痛閾值的變化Fig 2 Changes of pain thresholds of contralateral foot after medication in each group

圖3 各組大鼠給藥后同側(cè)腳痛閾值的變化Fig 3 Changes of pain thresholds of ipsilateral foot after medication in each group

圖4 鞘內(nèi)注射多塞平對(duì)骨癌疼痛模型大鼠的量效曲線Fig 4 Dose-effect curves of intrathecal injection of doxepin on bone cancer pain rat

4 討論

癌癥如果預(yù)后不良，這些源于乳腺、肺、前列腺的癌癥就會(huì)轉(zhuǎn)移至骨骼，超過(guò)70%的晚期乳腺癌、前列腺癌等的患者都會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過(guò)敏和異常性疼痛[8]。目前研究癌痛機(jī)制主要以骨癌疼痛模型為主。在實(shí)際臨床病例觀察中，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到骨或原發(fā)腫瘤在骨內(nèi)，都會(huì)出現(xiàn)劇烈的疼痛；并且隨著骨質(zhì)的破壞，疼痛程度加劇。一般易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的腫瘤有肺癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等。應(yīng)用Walker256細(xì)胞建立骨癌疼痛模型的優(yōu)點(diǎn)有：（1）表現(xiàn)出與人類骨癌疼痛相似的痛覺行為；（2）疼痛程度量指標(biāo)檢測(cè)容易，定量較精確；（3）模型制備成功率較高，制備過(guò)程比較容易，有較好的實(shí)用性[9]。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多塞平等三環(huán)類抗抑郁藥在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床均具有鎮(zhèn)痛的作用，且未見報(bào)道具有成癮性及耐受性，多塞平可以劑量依賴性地降低小鼠痛閾值，鞘內(nèi)注射可以抑制小鼠福爾馬林誘發(fā)的疼痛，臨床上可用來(lái)治療神經(jīng)源性疼痛等，而且癌癥疼痛患者如果聯(lián)用多塞平和阿片類鎮(zhèn)痛藥可以增加鎮(zhèn)痛效果，減少阿片類藥物的用量[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠造模成功疼痛只發(fā)生在造模同側(cè)腳，對(duì)于造模對(duì)側(cè)腳的痛閾值無(wú)明顯影響，與李曉青等[9]的研究結(jié)果一致。由此推測(cè)，腫瘤細(xì)胞已經(jīng)在大鼠造模同側(cè)腳骨髓腔成瘤生成，并未轉(zhuǎn)移到對(duì)側(cè)腳。鞘內(nèi)注射多塞平對(duì)于骨癌疼痛模型大鼠同側(cè)腳可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，1 000 μg·kg－1的Emax與嗎啡1 000 μg·kg－1的Emax比較無(wú)明顯差異，顯示出多塞平對(duì)于骨癌疼痛具有鎮(zhèn)痛作用，可以作為治療癌性疼痛的一個(gè)新的選擇，但其具體的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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