HPLC法測定胎盤灌流液中安替比林濃度Δ

吳暉，孫谷韻，姚勤，周瓊，鄧楊林，黃樺，張峻#（.昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床藥學中心，昆明 65003；.昆明醫(yī)學院，昆明 65003）

離體胎盤灌注技術將剛分娩出的胎盤進行小葉分離、灌注并建立胎兒母體雙循環(huán)模型，在體外模擬人體子宮，為原來無法在孕婦體內完成的胎盤透過性研究提供了一種可行的途徑。該技術目前已成為研究外來物質（如藥物、毒物、環(huán)境污染物等）能否透過胎盤、對胎兒造成暴露的經(jīng)典技術[1～3]。安替比林是一種解熱鎮(zhèn)痛藥，因其對胎盤具有穩(wěn)定的透過性，成為了應用離體胎盤灌注技術研究胎盤透過性的質量控制指標。其胎盤透過率是胎盤膜轉運功能的特異性指標，是評價離體胎盤灌流是否成功、是否可用于胎盤透過性研究的關鍵[4]。本文建立了專屬性強、靈敏度高的藥物分析方法測定胎盤灌流液中安替比林濃度，以便準確計算安替比林胎盤透過率，保證離體胎盤灌注技術的質量控制。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)，包括600二元泵、717自動進樣器、2996二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；AL104-IC型電子分析天平（美國梅特勒-托利多公司）；CHN868系pH計（美國梅特勒-托利多公司）；80-2B離心機（上海安亭科學儀器廠）；ZH-2自動渦旋混合器（天津藥典標準儀器廠）；MTN-2800D氮吹濃縮儀（天津奧特塞恩斯）。

1.2 試藥

安替比林標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100506-200301）；內標：非那西丁標準品（瑞士Fluka公司，批號：S3270413806B18）；牛血清白蛋白（BSA，美國Roche公司，批號：10735078001）；Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer干粉（美國Sigma公司，批號：029K08）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶0.05 mol·L－1磷酸氫二鈉緩沖液（用氫氧化鈉調節(jié)pH為6.5）＝70∶30；流速：1 mL·min－1；進樣量：20 μL；檢測波長：254 nm；柱溫：35℃。

2.2 溶液的制備

準確稱取安替比林標準品25.0 mg于25 mL容量瓶，加甲醇稀釋至刻度得1 000 mg·L－1標準貯備母液，2～8℃儲存?zhèn)溆谩蚀_稱取非那西丁標準品（內標）5.0 mg于50 mL容量瓶，加甲醇稀釋至刻度得100 mg·L－1標準液，2～8℃儲存?zhèn)溆?。胎盤灌流液按Shintaku等的方法[5]進行配制，即稱取0.95 g Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer干粉于70 mL純水溶解，再加入碳酸氫鈉0.126 g充分溶解后加入肝素2 500 u、2支80萬u青霉素、低分子右旋糖酐鐵5 mL充分混勻，最后加純水至100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 樣品處理

將新配制含藥樣品（即新鮮配制的胎盤灌流液加入適量安替比林標準溶液）0.5 mL與內標（100 mg·L－1非那西?。┤芤?0 μL，于離心試管中混合均勻，再加入三氯甲烷2 mL，渦旋混勻1 min后，4 000 r·min－1離心10 min，吸取有機相于干凈離心管中，35～40 ℃空氣流吹干。甲醇200 μL復溶30 s，取20 μ L進樣分析。

2.4 標準曲線的制備

精密加入安替比林標準溶液適量于空白胎盤灌流液中，使藥物濃度分別為20、16、10.24 、8.192、4.194 、2.147 、1.095 mg·L－1，與內標（100 mg·L－1非那西?。┤芤?0 μL混合均勻，按“2.3”項下方法處理后按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜。以安替比林濃度（c）對安替比林與內標的峰面積比值（A）進行線性回歸，得標準曲線方程為：A＝0.006 4c－0.011 2（r＝0.999 6），結果表明，安替比林檢測濃度在1.095～20 mg·L－1范圍內線性關系良好，測定方法的定量下限為1.095 mg·L－1，RSD為8.73%（n＝5）。

2.5 專屬性考察

按“2.1”項下色譜條件，考察安替比林和非那西丁在胎盤灌流液的色譜行為，并與安替比林和非那西丁標準品進行比較。結果，安替比林和內標的保留時間分別為4.5 min和14.3 min，二者峰形良好，分離完全，無雜質峰干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白胎盤灌流液；B.安替比林標準品；C.非那西丁標準品；D.胎盤灌流液樣品；1.安替比林；2.非那西丁Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank placental perfusion；B.antipyrine standard；C.phenacetin standard；D.placental perfusion sample；1.antipyrine；2.phenacetin

2.6 方法精密度與回收率試驗

配制低、中、高3種濃度（2.147、8.192、16 mg·L－1）的灌流液質控樣品，按“2.1”項下色譜條件進行分析，同日內制備各濃度并測定5個樣品，在不同日連續(xù)制備并測定5個分析批，計算日內、日間精密度及方法回收率?；厥章始熬芏仍囼灲Y果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結果Tab 1 Recovery and precision test results

2.7 穩(wěn)定性考察

將安替比林和內標非那西丁的標準溶液于4℃環(huán)境下保存放置，在不同時間內（24 h、7 d、14 d、30 d）測定含量，結果偏倚≤4.17%，RSD＝0.69%，表明標準溶液在4℃環(huán)境下保存30 d性質穩(wěn)定。灌流液樣品在－20℃冰箱冷凍保存，在不同時間內（24 h、3 d、7 d）測定含量，結果偏倚均≤8.3%，RSD＝1.53%，表明灌流液樣品在－20℃冰箱冷凍保存性質穩(wěn)定。質和結構特征，分別比較了乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷等溶劑的萃取效果，結果以三氯甲烷的除雜質能力最強，同時提取回收率較高。故采用三氯甲烷進行液-液萃取的方法制備樣品。該方法操作簡便，可適用于國內大多數(shù)實驗室的工作條件，為安替比林胎盤透過率的測定提供了簡便、經(jīng)濟的藥物分析方法。

3 討論

安替比林是應用離體胎盤灌流技術研究胎盤透過性的質量控制指標。近年來國外研究者多數(shù)應用高效液相色譜法測定胎盤灌流過程中安替比林的濃度變化來計算安替比林胎盤透過率[4～6，7]，以便評價離體胎盤灌流是否成功。國內目前尚無測定胎盤灌流液中安替比林的方法學報道，本研究中筆者首次對胎盤灌流液介質中的藥物分析方法進行探索。

胎盤灌流液成分復雜，含有無機離子、礦物元素、葡萄糖、激素、蛋白質等多種成分。國外文獻報道多為高效液相色譜法，其將胎盤灌流液樣本經(jīng)不同試劑多次蛋白沉淀后，高速離心取上清液進樣[8，9]。這種方法處理過程較為復雜，不僅因多次沉淀降低了樣品濃度，增加了檢測難度，并且對離心速度要求較高，試驗條件較難達到。本研究針對灌流液成分理化性

[1]Myren M，Mose T，Mathiesen L，et al.The human placenta an alternative for studying foetal exposure[J].Toxicol Vitro，2007，21（7）：1 332.

[2]Balakrishnan B，Henare K，Thorstensen EB，et al.Transfer of bisphenol A across the human placenta[J].Am J Obstet Gynecol，2010，202（4）：393.

[3]Balakrishnan B，Thorstensen EB，PonnampalamAP，et al.Transplacental transfer and biotransformation of genistein in human placenta[J].Placenta，2010，31（6）：506.

[4]Mathiesen L，Mose T，Morck TJ，et al.Quality assessment of a placental perfusion protocol[J].Reproductive Toxicology，2010，30（1）：138.

[5]Shintaku K，Arima Y，Dan Y，et al.Kinetic analysis of the transport of salicylic acid，a nonsteroidal anti-inflammatory drug，across human placenta[J].Drug Metabolism and Disposition，2007，35（5）：772.

[6]NemmarA，Hamoir J，Nemery B，et al.Evaluation of particle translocation across the alveolo-capillary barrier in isolated perfused rabbit lung model[J].Toxicology，2005，208（1）：105.

[7]Gedeon C，Behravan J，Koren G.Transport of glyburide by placental ABC transporters：implications in fetal drug exposure[J].Placenta，2006，27（11）：1 092.

[8]Line M，Erik R，Tina M，et al.Transport of benzo[α]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model：effect of albumin in the perfusion medium[J].Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology，2009，105（3）：181.

[9]Myllynen PK，Pienim?ki PK，V?h?kangas KH.Transplacental passage of lamotrigine in a human placental perfusion systemin vitro and in maternal and cord blood in vivo[J].Eur J Clin Pharmacol，2003，58（10）：677.