白藜蘆醇對老年大鼠心肌細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C氧化酶表達(dá)的影響

夏立志 胡秋玲 (哈爾濱市二四二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150066)

隨著人口老齡化，提高老年人的生活質(zhì)量，延緩衰老一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。線粒體在進(jìn)行有氧呼吸時，伴有自由基的產(chǎn)生，將引起衰老。因此，清除自由基、保護(hù)線粒體的天然藥物對于抗衰老發(fā)揮重要作用〔1〕。白藜蘆醇對動脈粥樣硬化有保護(hù)作用，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化等作用〔2〕，但白藜蘆醇對老年大鼠心肌線粒體能量代謝的影響未見報道。本實(shí)驗旨在為抗衰老藥物開發(fā)提供實(shí)驗依據(jù)，同時為老年心臟病患者的康復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 純系雄性SD大鼠30只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，3月齡大鼠10只作為青年組，體重(300±41.5)g;24月齡大鼠20只，體重(700±83.5)g，隨機(jī)分為老年組和用藥組，每組10只。室溫飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 藥物與處理 白藜蘆醇由本實(shí)驗室從虎杖中提取(99%，HPLC)，白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品由 sigma公司提供，實(shí)驗時用蒸餾水配成混懸液。用藥組每日予白藜蘆醇(70 mg/kg)連續(xù)灌胃4 w。每周稱重2次，根據(jù)體重調(diào)整劑量。青年組和老年組均灌胃等容量生理鹽水。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 心肌線粒體的提取 給藥4 w后斷髓處死。迅速取出心臟，一部分液氮凍存，用于提取組織 RNA。另外部分剪成小塊后立即用介質(zhì)Ⅰ(0.25 mol/L蔗糖溶液，3.0 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L EDTA，pH7.4)去除血污，用濾紙吸去表面的液體，稱重，勻漿，600 r/min離心5 min，取上清液于10000 r/min離心10 min。沉淀用介質(zhì)Ⅱ(0.25 mol/L蔗糖溶液，2.0 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L EDTA，pH7.4)懸浮，10000 r/min 離心10 min，沉淀懸浮在0.5 ml介質(zhì) Ⅱ 中，制備成線粒體懸液備用〔3〕。另一部分線粒體懸液經(jīng)超聲波粉碎機(jī)粉碎，400 A，5 s/次，間隙 10 s，反復(fù) 4次使線粒體微粒破碎，4℃ 離心(2000 r/min，10 min)，取上清液供酶活力測定。以上操作皆在4℃ 以下進(jìn)行。另一部分線粒體懸液直接供丙二醛(MDA)與蛋白質(zhì)的測定。

1.3.2 測定方法 心肌線粒體蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G250法;超氧化物歧化酶(Mn－SOD)活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法;心肌線粒體MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸(TBA)法;線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅳ(CoⅣ)活力測定采用王學(xué)美等〔4〕的方法。CoⅣ mRNA表達(dá)采用 RT－PCR方法，CoⅣ和甘油醛－3－磷酸脫氨酸(GAPDH)引物序列用Prime軟件進(jìn)行設(shè)計，并由上海生工合成，CoⅣ引物序列:上游:5′ACTACCCCTTGCCTGATGTG3′，下 游:5′ACTCATTGGTGCCCTTGTTC3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度 171 bp;內(nèi)參照 GAPDH:上游:5′CCACCACCATCTTCCAGGAG3′，下 游:5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度572 bp。用 Trizol試劑盒 (上海生工生物公司)提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;以GAPDH為內(nèi)對照，進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性3 min后，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共進(jìn)行 30 次循環(huán)，最后72℃ 延伸5 min，4℃ 冷卻終止反應(yīng)。以 GAPDH為內(nèi)參照同時進(jìn)行PCR。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。用GDS8000凝膠掃描分析系統(tǒng)分別對CoⅣ和GAPDH進(jìn)行吸光度掃描，計算出CoⅣ基因表達(dá)量與GAPDH基因表達(dá)量的比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有測定指標(biāo)均采用±s表示，多組數(shù)據(jù)組間比較采用F檢驗和q檢驗，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對大鼠心肌線粒體內(nèi)Mn－SOD活力和MDA含量及CoⅣ活性的影響 與青年組比較，老年組大鼠心肌線粒體內(nèi)Mn－SOD的活性降低，CoⅣ活性降低，MDA含量增加;與老年組比較，用藥組Mn－SOD活性增加，CoⅣ活性增加，MDA含量降低。見表1。

2.2 白藜蘆醇對老年大鼠心肌COⅣmRNA水平影響 各組在分子量171 bp處均出現(xiàn)DNA條帶。與青年組(1.34±0.158)相比，老年組CoⅣmRNA水平(3.75±0.26)顯著升高(P＜0.05);用藥組(2.48±0.19)與老年組比較，CoⅣ mRNA表達(dá)減低(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

表1 白藜蘆醇對大鼠心肌線粒體內(nèi)Mn-SOD活力、MDA含量和CoⅣ活性的影響( ± s，n=10)

表1 白藜蘆醇對大鼠心肌線粒體內(nèi)Mn-SOD活力、MDA含量和CoⅣ活性的影響( ± s，n=10)

與老年組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.001

組別Mn－SOD 活性(U/mg)MDA(nmol/mg)CoⅣ活性(μmol·min－1·mg－1青年組 46.25±4.041) 63.38±5.041) 2468.58±405.342)老年組 20.47±2.18 95.74 ±8.36 937.56±248.99用藥組 43.69±3.821) 76.65±7.371) 1983.46±402.532)

圖1 白藜蘆醇對老年大鼠心肌CoⅣmRNA表達(dá)的影響

3 討論

近年的研究發(fā)現(xiàn)自由基引起的生物膜脂質(zhì)過氧化與衰老密切相關(guān)。Mn－SOD是一種存在于細(xì)胞線粒體中的能夠清除超氧化物自由基的酶，但隨著年齡的增加，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)Mn－SOD活性減弱，由于抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生的減少，脂質(zhì)過氧化中間產(chǎn)物MDA增加〔5〕，將導(dǎo)致機(jī)體衰老。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與青年組比較，老年大鼠MDA含量增加，Mn－SOD活性減低。使用天然藥物白藜蘆醇后，能顯著提高老年大鼠心肌線粒體Mn－SOD活力，減低MDA含量，機(jī)制可能為:①白藜蘆醇具有抗氧化成分，可直接中和氧自由基，使 Mn－SOD消耗減少，活力上升;②白藜蘆醇可能具有刺激SOD活性的組分，使其活力增加;③白藜蘆醇有效的抗氧化成分直接抑制線粒體膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使MDA含量降低。

線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈通過生物氧化產(chǎn)生機(jī)體需要的能量。CoⅣ是呼吸鏈酶中的關(guān)鍵酶，其酶活性變化直接影響整個呼吸鏈的功能變化，CoⅣ又是最不穩(wěn)定、最脆弱、最易受損的酶，尤其易受自由基氧化損傷，引起電子傳遞過程中電子漏失，電子傳遞效率下降，自由基產(chǎn)生增多，進(jìn)一步影響呼吸鏈功能，使ATP合成進(jìn)一步減少，最終造成不可逆的損傷〔6～9〕。本研究結(jié)果表明，老年大鼠的心肌線粒體CoⅣ活性降低，在給予白藜蘆醇后，酶復(fù)合物的活性有所提高。進(jìn)一步分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠CoⅣmRNA表達(dá)增加，白藜蘆醇干預(yù)后CoⅣmRNA表達(dá)降低，分析原因可能是為了維持機(jī)體正常代謝所需的能量，而產(chǎn)生更多的輔酶蛋白補(bǔ)充，從而刺激CoⅣ表達(dá)增加。

以上的研究提示，白藜蘆醇通過增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化作用，減少氧化產(chǎn)物對輔酶功能的損傷，從而使輔酶活性提高，進(jìn)而降低對CoⅣmRNA水平反饋調(diào)節(jié)，以維持線粒體功能，進(jìn)而改善心肌的能量代謝。

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