HBV對肝癌細胞系 HepG2和 HepG2.2.15中MMP-2及MMP-9的表達影響

馮 華，吳 丹，金曉明

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江157011;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，哈爾濱150040;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理教研室，哈爾濱150081)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高，起病隱匿，臨床缺乏有效的預(yù)防、檢測及治療手段，治愈率低下，在世界范圍內(nèi)，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC最重要的病因，HBV復(fù)制在肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，甚至肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)階段都可能起重要作用。最近許多研究表明，HBV基因型、病毒變異、HBV-DNA水平與HCC存在一定的關(guān)系，卻還沒有統(tǒng)一觀點，甚至出現(xiàn)相反的結(jié)論。HBV致HCC的確切機制目前還不清楚。該項實驗通過對人肝癌細胞系(HepG2，HepG2.2.15)中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9的表達情況的研究及對腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響來探討HBV導(dǎo)致HCC的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細胞購于中科院上海細胞庫。人肝癌 HepG2.2.15細胞由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室惠贈。細胞培養(yǎng)液DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)由 Hyclone公司提供。胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司(HepG2細胞)及Gibco公司(HepG 2.2.15細胞)提供。明膠酶譜法所需試劑由Sigma公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2細胞和 HepG2.2.15細胞用含10%胎牛血清，100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，其中HepG2.2.15培養(yǎng)液中加入250 mg/L的 G418;及 2 mmol/L谷氨酰胺，25 mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液和1 mmol/L丙酮酸鈉，細胞均于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液2～3 d更換一次，待細胞生長至80%左右時進行傳代。HepG2.2.15細胞的培養(yǎng)要求符合二級生物安全標準，所有培養(yǎng)廢液按照傳染源處理。

1.2.2 細胞生長曲線測定 將兩種細胞經(jīng)胰酶消化后，細胞計數(shù)板計數(shù)，按照1×104細胞/孔接種于24孔板，次日起每天消化計數(shù)3個復(fù)孔，測定細胞數(shù)，取平均值，連續(xù)計數(shù)7 d。

1.2.3 明膠酶譜 細胞傳代，調(diào)整兩種細胞的細胞數(shù)。使之在1×106/瓶，培養(yǎng)1 d后吸去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，分別加入無血清的DMEM 2 mL/瓶，48 h后吸取培養(yǎng)液離心(3000 r/min)10 min。取上清－80℃凍存?zhèn)溆?。根?jù)Kleiner等的方法加以改進酶譜法(SDS-PAGE enzymography):取無血清培養(yǎng)液4 μL與4×上樣緩沖液混勻，放置于37℃孵箱中孵育30 min。取混合后樣品20 μL上樣于含1 g/L明膠的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中，80 V恒壓下電泳，當(dāng)溴酚藍跑至分離膠與濃縮膠分離處時改為120 V恒壓直到溴酚藍跑至凝膠底部，取出凝膠放于搖床中，用含25 mL/L TritonX-100的洗脫液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，20 mmol/L ZnCl2)振蕩洗脫3 次，每次30 min，然后加入適量孵育液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，20 mmol/L ZnCl2)置于37 ℃恒溫箱中孵育24 h，用染色液(0.1%考馬斯亮藍R-250，30%甲醇，10%冰乙酸)染色2 h，再用脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10%，冰乙酸濃度分別為 10%、10%、5%)分別脫色 30 min、1 h、2 h，此刻即可呈現(xiàn)出MMPs位于藍色背景下的白色透明條帶。將電泳凝膠在灰階模式下掃描，應(yīng)用Band leader 3.0軟件分析，設(shè)定參考值，讀取條帶面積和酶解條帶灰度，酶表達量=條帶面積×(平均灰度值－背景灰度值)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 15.0軟件所得的HepG2細胞和HepG2.2.15細胞的 MMP-2和 MMP-9的酶表達量進行統(tǒng)計處理，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞生長曲線 在第1天HepG2細胞和生長速度慢于HepG2.2.15細胞，在第2天以后，其生長速度則明顯快于 HepG2.2.15 細胞(F=11.290，P ＜0.05)(表1，圖 1)。

表1 HepG2和HepG2.2.15細胞生長速度(細胞數(shù)×5000)

圖1 細胞計數(shù)

2.2 明膠酶譜檢測兩種細胞中MMP-9和MMP-2的表達情況 MMP-9在HepG2細胞中的表達高于HepG2.2.15細胞(P ＜0.05)，MMP-2 在 HepG2 細胞和HepG2.2.15細胞中的比較，表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(表2)。

表2 明膠酶譜檢測2種細胞中MMP-2和MMP-9的表達情況

3 討論

HCC是我國最常見的惡性腫瘤之一，浸潤和轉(zhuǎn)移是HCC重要的惡性生物學(xué)行為，是制約臨床治療效果的重要因素。轉(zhuǎn)移的過程雖然復(fù)雜，但其中細胞外基質(zhì)的降解和細胞表面黏附分子的改變是最重要的原因［1］。MMPs家族即是在此過程中發(fā)揮重要作用的一類蛋白水解酶。其中，MMP-2、MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，其在腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移灶的形成以及腫瘤血管化的過程中均起重要作用［2-3］。

HBx是HBV病毒中一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，能影響細胞基因的轉(zhuǎn)錄，激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進病毒復(fù)制，加速蛋白降解，調(diào)控細胞周期，調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和肝細胞發(fā)生癌變等。HBx基因如何導(dǎo)致細胞向惡性變發(fā)展成為近年來研究的熱點，但明確的報道十分罕見。一些研究指出，HBVx蛋白可調(diào)控p21WAF1/CIP1蛋白的表達，從而影響細胞正常的代謝活動。p21WAF1/CIP1蛋白具有抗宿主細胞變異和復(fù)制、增殖的功能，由此發(fā)揮其抑癌作用。p21WAF1/CIP1蛋白在細胞凋亡中有雙重表現(xiàn)。一方面，p21WAF1/CIP1蛋白可抑制凋亡:p21的N端通過與caspase-3前體結(jié)合，使其不能活化，喪失對蛋白激酶的活化作用，受損細胞免于Fas介導(dǎo)的細胞凋亡。另一方面，p21WAF1/CIP1蛋白通過對細胞周期的阻滯間接參與了細胞凋亡。

HBx是肝細胞發(fā)生癌變的重要基因，它通過與細胞因子或蛋白結(jié)合而發(fā)揮肝癌變作用，在慢性HBV感染的肝臟細胞中，HBx可通過調(diào)控p21WAF1/CIP1基因的表達，發(fā)揮它在HBV相關(guān)性HCC中的癌變作用。HBx在不同的細胞狀態(tài)既可上調(diào)該基因的表達量，延長細胞從G1期進展到S期，也可下調(diào)p21WAF1/CIP1基因的表達，使受損的異常細胞無控制地增殖，導(dǎo)致HCC的發(fā)生。

該項實驗研究所用的細胞系HepG2.2.15細胞來源于HepG2細胞，其中轉(zhuǎn)染了HBV并能穩(wěn)定復(fù)制。白文林等［4］的研究結(jié)果表明，HepG2.2.15 細胞所表達的p53的量較HepG2細胞所表達量為高。HBV在HepG2.2.15細胞中的復(fù)制對p53的表達及功能并沒有產(chǎn)生抑制作用，反而具有一定的促進作用。HBV作為一種病毒，它在細胞內(nèi)的復(fù)制有可能作為激發(fā)p53活性的因素，使p53的表達及功能增強，進而可能導(dǎo)致細胞某些生物學(xué)活性(如細胞凋亡、細胞周期等)的改變，可能是細胞感染HBV后的保護性反應(yīng)。這與本研究結(jié)果也具有相似性，即HBV促進了肝癌細胞的凋亡，使HepG2.2.15細胞的生長速度慢于HepG2細胞。

Saito等［5］發(fā)現(xiàn)大多數(shù) MMPs是腫瘤細胞分泌的，但更多情況下是由宿主細胞，如巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等分泌，因此MMPs表達被認為是一種誘導(dǎo)的宿主反應(yīng)。這提示腫瘤細胞可以通過可溶性介質(zhì)或膜結(jié)合分子與間質(zhì)細胞進行信息交換，有利于腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究中明膠酶譜結(jié)果顯示，HepG2細胞中的MMP-9的表達水平高于 HepG2.2.15細胞。提示HBV中的HBx可能通過調(diào)控p21WAF1/CIP1基因的表達，上調(diào)該基因的活性，繼而使p53的表達增強，從而促進細胞凋亡的發(fā)生，使 HepG2.2.15細胞分泌MMPs的量減少，從而影響了其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。對于同一細胞中MMP-2和MMP-9表達水平的差異，其可能的機制為:①兩者的調(diào)節(jié)機制不同，MMP-9的轉(zhuǎn)錄是由細胞因子(白細胞介素1、腫瘤壞死因子α等和表皮生長因子、血小板源性生長因子等)調(diào)控的，而MMP-2則由轉(zhuǎn)化生長因子β調(diào)控。②兩者在基膜和細胞外基質(zhì)破壞的方式及程度，以及促進腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移中所起的作用不同。其詳盡機制目前仍未明了，推測可能與細胞的特異性有關(guān)。

綜上所述，HBV可通過多種途徑抑制HCC的生長，通過明膠酶分泌量的減少而影響其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。隨著對HBV相關(guān)機制的深入研究，對HCC與HBV相互關(guān)系的研究具有一定的指導(dǎo)意義。MMP-2和MMP-9的高表達可促進HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移。該項研究對于特異性明膠酶抑制劑的研究及臨床應(yīng)用也具有一定的指導(dǎo)意義。

［1］劉亮明，羅文，劉晶美，等.HBX在原發(fā)性肝癌發(fā)病中的作用及其生物治療策略［J］.世界華人消化雜志，2005，13(4):432-439.

［2］Chamber AF，Matrisian LM.Changing views of matrix metalloproteinase in metastasis［J］.Natl Cancer Inst，1997，89(6):1260-1265.

［3］Parsons SL，Watson SA，Collins HM，et al.Gelatinase(MMP-2 and MMP-9)expression in gastrointestinal malignancy［J］.Br J Cancer，1998，78(11):1495-1502.

［4］白文林，曲建，慧樓敏，等.HepG2與 HepG2.2.15細胞中p53表達及活性的比較［J］.實用肝臟病雜志，2008，11(5):295-311.

［5］Saito K，Takeha S，Shiba K，et al.Clinicopathologic significance of urokinase receptor and MMPS-9 positive stromal cells in human colorectal cancer:functional multiplicity of matrix degradation on hematogenous matastasis［J］.Int J Cancer，2000，86(1):24-29.