中等嗜熱菌浸出黃銅礦的溫度影響規(guī)律及種群組成分析

溫建康，徐金光，陳勃偉，武彪，姚國成, ，劉美林，王淀佐,

(1. 北京有色金屬研究總院 生物冶金國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京，100088；2. 中國瑞林工程技術(shù)有限公司，江西 南昌，330002；3. 北京科技大學(xué) 土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京，100083；4. 中國工程院，北京，100088)

中國銅礦資源中大部分為硫化銅礦，而其中原生硫化銅礦，即黃銅礦又占很大比例。隨著開采品位的不斷下降，低品位銅礦采用傳統(tǒng)選冶工藝已逐漸不適用，生物冶金技術(shù)以其工藝流程短、投資省、生產(chǎn)成本低及環(huán)保等諸多優(yōu)勢已逐步得到工業(yè)應(yīng)用[1]，但目前采用常溫浸礦菌處理黃銅礦難以達(dá)到理想的銅浸出效果。研究表明極端嗜熱菌對黃銅礦具有較好的浸出效果[2]，但由于極端嗜熱菌工業(yè)放大培養(yǎng)難和高溫狀態(tài)下氣液傳輸?shù)碾y度要求較高，實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用還沒有取得重大突破。中等嗜熱菌對黃銅礦的浸出效果較常溫菌具有很大優(yōu)勢，浸出速度快、浸出率高[3-4]；低品位硫化銅礦的細(xì)菌堆浸過程中，堆的內(nèi)部溫度一般可以達(dá)到40～50 ℃，正好是中等嗜熱菌的最佳生長溫度條件，相對極端嗜熱菌來說更容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)上的應(yīng)用。目前，針對中等嗜熱菌浸出黃銅礦的實(shí)驗(yàn)室研究較多[5-7]，但鮮見關(guān)于實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道。溫度是影響浸礦細(xì)菌生長和繁殖的最重要因素之一[8]。在一定溫度范圍內(nèi)，微生物的代謝活動(dòng)與生長繁殖隨溫度的上升而增加，溫度上升到一定程度，開始對機(jī)體產(chǎn)生不利影響，如果溫度繼續(xù)升高，細(xì)胞功能會急劇下降，以至死亡。各種浸礦細(xì)菌有其能進(jìn)行生長的最低溫度、生長速率最大的最適溫度和熱變性破壞反應(yīng)占主導(dǎo)的最高溫度[9]。一般認(rèn)為，在最低溫度和最高溫度時(shí)，細(xì)菌生長速率可視為零；在最適溫度時(shí)，生長速率最大。當(dāng)溫度向最適溫度升高時(shí)，每升高10 ℃，生長速率約增加1倍；當(dāng)溫度高于最適溫度時(shí)，生長速率降低，并可能發(fā)生熱死亡。因此，探明中等嗜熱菌浸出黃銅礦的溫度影響因素和浸礦過程微生物種群組成，對提高黃銅礦微生物浸礦效率具有重要意義。本文作者研究溫度對中等嗜熱菌浸出黃銅礦過程中的影響規(guī)律，并采用16S rDNA克隆文庫分析中等嗜熱菌在不同溫度條件下浸礦過程中的優(yōu)勢浸礦菌的組成，考察45 ℃和60 ℃條件下浸礦細(xì)菌的優(yōu)勢菌以及它們之間對黃銅礦浸出過程中所起的作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 礦樣

試驗(yàn)礦樣來自江西德興銅礦的黃銅礦浮選精礦，含有的主要礦物是黃銅礦，其次是輝銅礦、斑銅礦及脈石礦物，另有少量黃鐵礦。礦樣的礦物組成見表1，化學(xué)元素分析結(jié)果見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)礦樣的礦物組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Table 1 Mineralogical composition of ore %

表2 實(shí)驗(yàn)礦樣的化學(xué)成分(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Table 2 Chemical composition of ore %

1.2 菌種

實(shí)驗(yàn)用菌種為本實(shí)驗(yàn)室所保存的中等嗜熱菌混合菌，該混合菌種的原始菌采集自云南墨江鎳礦生物堆浸廠和江西德興銅礦廢石堆浸礦區(qū)，最適生長溫度為45～55 ℃，適宜pH范圍1.0～2.2，生物顯微鏡下觀察其形態(tài)主要包括長桿狀、短桿狀和螺旋狀，長為1.0～3.0 μm，可氧化 Fe2+、硫化礦及單質(zhì)硫。培養(yǎng)條件為9K培養(yǎng)基，組成為：3.0 g/L (NH4)2SO4，0.1 g/L KCl，0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4和 0.01 g/L Ca(NO3)2。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 搖瓶浸出

在250 mL錐形瓶中加入90 mL的無鐵9K培養(yǎng)基和10 mL的接種液，并加入2 g粒度小于30 μm的黃銅礦精礦，用稀硫酸溶液調(diào)pH至1.75。分別在12，33，45和70 ℃的搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，每隔一段時(shí)間測定培養(yǎng)液中pH、氧化還原電位和Cu2+濃度。

1.3.2 攪拌浸出

黃銅礦攪拌浸出反應(yīng)器如圖1所示。采用鍍膜(聚四氟)不銹鋼制成，總體積為3 L。反應(yīng)器裝有在線檢測 pH和氧化還原電位的裝置，同時(shí)也可充氣。浸出過程中礦漿固液比為1%，礦物粒度D90=74 μm，攪拌轉(zhuǎn)速為160 r/min。初始細(xì)菌濃度為1.08×107mL-1、空氣流量0.1 m3/h，浸出過程中每天間隔一定時(shí)間用滅菌水補(bǔ)充蒸發(fā)水至定量，每隔24 h測定溶液pH及氧化還原電位(VORP)并取樣分析Cu2+濃度。

1.4 浸礦過程種群分析方法

1.4.1 DNA提取與純化

浸出結(jié)束后取45 ℃和60 ℃條件下浸出液各300 mL，參考Oved等的方法提取DNA[10]。具體步驟為：在12 000 r/min離心2 min。離心后的沉淀加入1.5 mL滅菌離心管，用超純水清洗2次；加入1.0 mL pH 8.0TE 溶液，100 μL 10%PVP，100 μL 20%SDS，465～600 μm滅菌玻璃珠0.6 g；振蕩器勻漿5 min；12 000 r/min離心1 min，上清轉(zhuǎn)移至干凈離心管，加入1/10體積的3 mol/L冰冷乙醇鈉，冰上放置10 min；12 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至干凈離心管，加入1 mL冰冷異丙醇，沉淀，冰上放置30 min；12 000 r/min離心10 min，用70%乙醇洗沉淀，50 μL TE溶解。粗提DNA采用Wizard DNA Clean-Up System Kit(Promega，USA)純化，- 20 ℃保存。

圖1 黃銅礦生物攪拌浸出反應(yīng)器示意圖Fig.1 Schematic diagram of stirred tank bioreactor for bioleaching of chalcopyrite

1.4.2 16S rDNA片段的擴(kuò)增和克隆文庫的構(gòu)建

用于擴(kuò)增細(xì)菌和古細(xì)菌的正向引物分別為27F和21F，反向引物均為1492R擴(kuò)增[11]。反應(yīng)體系：5倍緩沖液 10 μL，Mg2+(25 mmol/L) 3 μL，dNTP(10 mmol/L)1μL，27F(50 μmol/L) 0.5 μL，1492R(50 μmol/L) 0.5 μL，DNA 1 μL，Promega Flexi GoTaq 酶(5 U/μL) 0.25 μL，補(bǔ)滅菌去離子水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性2 min；再接 95 ℃，45 s；54 ℃，45 s；72 ℃，1 min；循環(huán)30次；最后于72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，用 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega,USA)回收。用Promega的pGEM T Easy Vector與擴(kuò)增的16S rDNA片段連接后，轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α(北京博大泰克)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆子，建立16S rDNA克隆文庫，克隆文庫通過Ampr平板保藏。

1.4.3 16S rDNA克隆文庫序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析及多樣性指數(shù)分析

挑取白色克隆后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA序列測定。獲得的序列采用Clustal X 進(jìn)行序列比對[12]，通過 RDP(Ribosomal Database Project)的CHIMERA_CHECK version 2.7將嵌合體序列排除。利用DOTUR軟件[13]對測得的序列劃分OTU，種群結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)分析采用 SPADE軟件[14]。利用BLAST軟件從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索相關(guān)菌株的16S rRNA 基因序列。用MEGA4 軟件[15]進(jìn)行多序列對位排列，并采用MEGA4軟件包中的Kimura 2-Parameter Distance模型及Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 檢測方法

細(xì)菌計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板在生物相差顯微鏡下觀察。pH和氧化還原電位(VORP)采用PC-350型控制器在線測量。溶氧濃度采用Mettler Toledo 4050e型溶氧儀和SmeR型記錄儀在線測量和記錄。

2 結(jié)果和討論

2.1 溫度對中等嗜熱菌浸出黃銅礦的影響

為初步考察溫度對中等嗜熱菌浸出黃銅礦的影響，通過搖瓶試驗(yàn)進(jìn)行12，33，45和70 ℃條件下的浸出試驗(yàn)，圖2所示為浸出過程中的pH和VORP隨時(shí)間的變化曲線，圖3所示為銅浸出率隨時(shí)間的變化曲線?？梢姡航鲞^程中浸礦細(xì)菌的活性決定了浸出速率的高低。在12 ℃條件下銅浸出速率很低，浸出25 d，銅浸出率只有10%左右，在33 ℃條件下，浸出速率明顯升高，但是在浸出進(jìn)行7 d后，浸出速率開始下降并一直維持在較低水平，最終浸出率為30%左右；相比12 ℃和33 ℃ 2個(gè)溫度水平，在45 ℃時(shí)為中等嗜熱菌的最適生長溫度，在該溫度水平下銅浸出速率最高，在浸出進(jìn)行12 d時(shí)，銅浸出率即可達(dá)到35%，之后銅浸出速率有所下降，此時(shí)細(xì)菌濃度檢測結(jié)果表明也是下降的，但是溶液 pH和氧化還原電位一直維持在適宜范圍，這種現(xiàn)象的可能原因是生成的黃鉀鐵礬造成的鈍化膜阻礙了浸出的持續(xù)進(jìn)行[16]，最終銅浸出率為42%；溫度升高到70 ℃時(shí)，浸出過程中pH亦呈先升高后降低的變化規(guī)律，但氧化還原電位一直維持在最低水平上，浸出速率較低，浸出過程中在該溫度水平下細(xì)菌濃度一直很低。

為進(jìn)一步考察溫度對中等嗜熱菌浸出黃銅礦的影響，研究了40，55和60 ℃條件下黃銅礦的攪拌浸出，結(jié)果如圖4～6所示。從圖4～6可以看出：40 ℃時(shí)細(xì)菌可以正常生長，銅浸出率隨細(xì)菌濃度增加而升高，pH維持在1.5至2.00之間，浸出液的氧化還原電位在浸出進(jìn)行9 d后升高到540 mV，期間銅浸出速率一直維持在高水平，浸出進(jìn)行12 d銅浸出率為20%，較45 ℃條件下銅的浸出速率要慢；55 ℃條件下，浸出過程中氧化還原電位一直維持在420 mV以下，pH先升高后緩慢下降，細(xì)菌生長速率逐步提高，并能保持較好活性，說明浸礦用中等嗜熱菌可以在該溫度水平下良好生長，但需要一段適應(yīng)期，經(jīng)過馴化后可以保持較好的生長和浸礦活性；60 ℃條件下，接種后細(xì)菌濃度逐漸下降，浸出進(jìn)行 8 d后細(xì)菌濃度維持在 1.0×106mL-1左右，但是銅浸出速率仍然保持在較高水平，表明浸礦用中等嗜熱菌群耐高溫能力較弱，但菌群中卻存在能在 60 ℃條件下存活并具有較強(qiáng)浸礦能力的某類浸礦菌[17]，同時(shí)在浸礦溫度40～60 ℃之間，溫度升高有利于加快銅的浸出進(jìn)行。

圖2 不同溫度條件下浸出過程中pH和ORP的變化Fig.2 Changes of pH and ORP with time at different temperatures

圖3 不同溫度條件下浸出過程中銅浸出率的變化Fig.3 Changes of copper leaching rate with time at different temperatures

2.2 中等嗜熱菌浸礦過程種群組成克隆文庫分析結(jié)果

前面在進(jìn)行不同溫度條件下采用中等嗜熱菌浸出黃銅礦精礦的搖瓶浸出和攪拌浸出中發(fā)現(xiàn)，不是在中等嗜熱菌的最佳生長溫度45～55 ℃，而是在60 ℃的高溫條件下，銅浸出速率仍然保持在較高水平。為了解在黃銅礦浸出過程中起作用的細(xì)菌種類，試驗(yàn)中采用16S rDNA克隆文庫分析45 ℃和60 ℃條件下中等嗜熱菌的組成。表3所示為45 ℃和60 ℃樣品中微生物種群的多樣性指數(shù)。從表3可以看出：微生物種群的多樣性不高，45 ℃和 60 ℃下 OTU(Operational taxonomic unit,操作分類單元)數(shù)目分別為4和5。從估計(jì)樣品覆蓋率可以看出覆蓋度較高。因此，所得數(shù)據(jù)能夠較好地反映浸出過程中的微生物種群的多樣性。

圖4 40 ℃條件下攪拌浸出結(jié)果Fig.4 Stirred tank bioleaching result at 40 ℃

圖5 55 ℃條件下攪拌浸出結(jié)果Fig.5 Stirred tank bioleaching result at 55 ℃

圖6 60 ℃條件下攪拌浸出結(jié)果Fig.6 Stirred tank bioleaching result at 60 ℃

將每個(gè) OTU的代表序列與 Genbank中的 16S rDNA數(shù)據(jù)比對，確定每個(gè)OTUs最相似的種，將相同的種歸為一類，確定不同種在種群中所占的比例，并做圓餅圖，如圖7和8所示?？梢姡?5 ℃和60 ℃條件下中等嗜熱菌的組成主要為Leptospirillumferriphilum，Acidithiobacillus caldus，Sulfobacillus thermotolerans和Acidosphaera rubrifaciens，其所占比例在45 ℃時(shí)分別為60%，16%，14%和10%，在60 ℃時(shí)分別為40%，30%，24%和6%。

表3 45 ℃和60 ℃樣品中微生物種群的多樣性指數(shù)Table 3 Microbial population diversity index at 45 ℃ and 60 ℃

圖7 45 ℃時(shí)浸出黃銅礦的中等嗜熱菌種群組成Fig.7 Composition of moderate thermophiles at 45 ℃

圖8 60 ℃時(shí)浸出黃銅礦的中等嗜熱菌種群組成Fig.8 Composition of moderate thermophiles at 60 ℃

另外，針對45 ℃和60 ℃條件下攪拌浸出過程中所含的古生菌進(jìn)行類似的分析，結(jié)果表明在45 ℃時(shí)未發(fā)現(xiàn)有古生菌存在，而在60 ℃時(shí)全部為Ferroplasma cupricumulans。

從中等嗜熱菌在45 ℃和60 ℃下的種群組成結(jié)構(gòu)可以看出：浸出過程中浸出液的優(yōu)勢菌均為Leptospirillum ferriphilum，在浸出黃銅礦的過程中，主要作用為不斷將溶解出來的Fe2+氧化成Fe3+。此外還存在較大比例的Acidithiobacillus caldus，該菌為中等嗜熱菌，其最佳生長溫度為45 ℃，可氧化還原態(tài)硫，不能氧化Fe2+，是黃銅礦浸出過程中還原態(tài)硫的主要氧化者。Sulfobacillus thermotolerans能夠以Fe2+、元素硫、還原態(tài)硫作為其能源基質(zhì)，可氧化黃銅礦浸出過程中產(chǎn)生的多硫化物中間介質(zhì)，最適溫度為40 ℃，但是能夠耐受較高的溫度。另外浸出液中亦發(fā)現(xiàn)不少的Acidosphaera rubrifaciens，該菌為異養(yǎng)菌，不能氧化鐵，也不能氧化硫，在系統(tǒng)中的作用主要是消耗自養(yǎng)菌產(chǎn)生的有機(jī)物，消除有機(jī)物對自養(yǎng)菌的抑制作用。

60 ℃時(shí)存在的古生菌Ferroplasma cupricumulans，細(xì)胞形狀不固定，缺少細(xì)胞壁，抗剪切力能力差，不能耐受攪拌浸出過程中的高礦漿濃度，只能以Fe2+為唯一能源，以無機(jī)碳為唯一碳源。

總的來說，在黃銅礦浸出過程中，Sulfobacillus thermotolerans和Leptospirillum ferriphilum可共同對溶液中的Fe2+進(jìn)行氧化，產(chǎn)生的Fe3+又對黃銅礦進(jìn)行氧化，礦物表面生成的S膜和還原態(tài)的多硫化物又可以作為At. caldus的能源物質(zhì)被氧化，使得浸礦菌和Fe3+可以更好地與礦物接觸，促進(jìn)浸出反應(yīng)的進(jìn)行。Acidosphaera rubrifaciens以及60 ℃時(shí)存在的古生菌Ferroplasma cupricumulans，能以其他浸礦細(xì)菌提供的有機(jī)物為能源，另外Ferroplasma cupricumulans也可氧化溶液中的Fe2+，促進(jìn)Fe3+濃度升高，從而加快黃銅礦的浸出?？梢哉f上述菌種的存在對浸出所起的作用是相輔相成的，它們共同促進(jìn)黃銅礦中銅的浸出。

3 結(jié)論

(1) 在12 ℃時(shí)中等嗜熱菌可以適應(yīng)生長，但銅浸出速率很低；33 ℃時(shí)浸出速率有所加快，說明隨著溫度升高浸礦菌生長活性也升高，從而提高了浸出效率；45 ℃為浸礦菌最適生長溫度，此時(shí)銅浸出速率最高；溫度升高到 70 ℃時(shí)，氧化還原電位一直維持在低水平，浸出過程中基本未發(fā)現(xiàn)有浸礦菌存在，中等嗜熱菌在70 ℃時(shí)不能夠存活。

(2) 40 ℃攪拌浸出時(shí)，中等嗜熱菌可以正常生長，銅浸出率隨細(xì)菌濃度增加而升高，期間銅浸出速率一直維持在較高水平；55 ℃時(shí)中等嗜熱菌可良好生長，但延滯期長，經(jīng)過馴化后可以保持較好的生長和較高的浸礦活性；溫度升至60 ℃時(shí)，浸出速度仍然較快，但細(xì)菌濃度較低，浸礦菌群中的部分類屬菌已失活。

(3) 45 ℃和 60 ℃條件下中等嗜熱菌組成主要為Leptospirillum ferriphilum，Acidithiobacillus caldus，Sulfobacillus thermotolerans和Acidosphaera rubrifaciens。在黃銅礦浸出過程中，Sulfobacillus thermotoleran和Leptospirillum ferriphilum可共同對溶液中的Fe2+進(jìn)行氧化，Acidthiobacillus caldus氧化礦物表面生成的S膜和還原態(tài)的多硫化物，促進(jìn)浸出反應(yīng)的進(jìn)行。60 ℃時(shí)存在的古生菌Ferroplasma cupricumulans可以利用其它浸礦細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)物為能源生長，同時(shí)氧化溶液中的Fe2+為Fe3+，保持浸礦過程中高水平的氧化還原電位。它們之間對浸出所起的作用是相輔相成的，可共同促進(jìn)黃銅礦的溶解。

[1]Brierley C L,Brierley T A. Copper bioleaching: State-ofthe-art[C]//Young S K,Dreisinger D B,Hackl R P,et al.Proceedings of the Copper99-Cober99 International Conference,Vol.Ⅳ—Hydrometallurgy of Copper. Warrendale,Pennsylvania:The Minerals,Metals & Materials Society,1999: 59-68.

[2]Petersen J,Dixon D G. Thermophilic heap leaching of a chalcopyrite concentrate[J]. Minerals Engineering,2002,15:777-785.

[3]舒榮波,阮仁滿,溫建康. 黃銅礦生物浸出中鈍化現(xiàn)象研究進(jìn)展[J]. 稀有金屬,2006,30(3): 395-400.SHU Rong-bo,RUAN Ren-man,WEN Jian-kang. Review on passivation of chalcopyrite during bioleaching process[J].Chinese Journal of Rare Metals,2006,30(3): 395-400.

[4]Sladen P J V. The Mintek/Bactech copper bioleach process[C]//Proceedings of Alta 1998 Copper Hydrometallurgy Forum and Sulphides Symposium. Victoria: Alta Metallurgical Services,1998: 13-23.

[5]鄧敬石,阮仁滿,溫建康,等. 中等嗜熱菌浸出硫化礦的研究現(xiàn)狀及展望[J]. 礦產(chǎn)綜合利用,2002,24(2): 33-38.DENG Jing-shi,RUAN Ren-man,WEN Jian-kang,et al. Present situation and prospects in bioleaching of sulphides by moderate thermophiles[J]. Multipurpose Utilization of Mineral Resources,2002,24(2): 33-38.

[6]Rohwerder T,Gehrke T,Kinzler K,et al. Bioleaching review part A: Progress in bioleaching: fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulfide oxidation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2003,63(3): 239-248.

[7]Donati E,Curutchet G,Pogliani C,et al. Bioleaching of covellite using pure and mixed cultures ofThiobacillus ferrooxidansandThiobacillus thiooxidans[J]. Process Biochemistry,1996,31(2):129-134.

[8]楊顯萬,沈慶峰,郭玉霞. 微生物濕法冶金[M]. 北京: 冶金工業(yè)出版社,2003: 65-163.YANG Xian-wan,SHEN Qing-feng,GUO Yu-xia. Microbial hydrometallurgy[M]. Beijing: Metallurgical Industry Press,2003:65-163.

[9]溫建康,姚國成,陳勃偉,等. 溫度對浸礦微生物活性及浸出速率的影響研究[J]. 北京科技大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(3): 295-299.WEN Jian-kang,YAO Guo-cheng,CHEN Bo-wei,et al. Effect of temperature on the activity of mineral-bioleaching microorganisms and the bioleaching rate of copper[J]. Journal of University of Science and Technology Beijing,2009,31(3):295-299.

[10]Oved T,Shaviv A,Goldrath T,et al. Influence of effluent irrigation on community composition and function of ammoniaoxidizing bacteria in soil[J]. Applied and Environmental Microbiology,2001,67(8): 3426-3433.

[11]Weisburg W G,Barns S M,Pelletier D A,et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology,1991,173(2): 697-703.

[12]Thompson J D,Gibson T J,Plewniak F. The ClustalX windows interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research,1997,24: 4876-4882.

[13]Schloss P D,Handelsman J. Introducing DOTUR: A computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness[J]. Applied and Environmental Microbiology,2005,71(3): 1501-1506.

[14]Chao A,Shen T J. Program SPADE (Species Prediction and Diversity Estimation). Program and user’s guide[EB/OL].[2009-02-13]. http://chao.stat.nthu.edu.tw.

[15]Schloss P D,Handelsman J. Introducing SONS,a tool for operational taxonomic unit-based comparisons of microbial community memberships and structures[J]. Applied and Environmental Microbiology,2006,72(10): 6773-6779.

[16]Wichlacz P L,Thompson D L. The effect of heterotrophic acidophilic bacteria on the leaching of cobalt byThiobacillus ferrooxidans[C]//Norris P R,Kelly D P. Biohydrometallurgy,Proceedings of the International Symposium 1987. Kew,United Kingdom: Science and Technology Letters,1988: 77-86.

[17]Third K A,Ruwish C R,Watling H R. The role of iron-oxidzing bacteria in stimulation or inhibition of chalcopyrite bioleaching[J]. Hydrometallurgy,2000,57: 225-233.