HPLC法測(cè)定人血漿中吉非替尼的濃度

李 翔，劉皈陽(yáng)，王明媚，王 芳，李 雷（解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科，北京 100037）

吉非替尼是第一個(gè)用于肺癌治療的蛋白激酶抑制藥，在體內(nèi)通過(guò)與三磷酸腺苷競(jìng)爭(zhēng)與表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，產(chǎn)生抗腫瘤活性作用，具有協(xié)同化療藥抗癌的效果，臨床主要用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌[1-2]。目前，吉非替尼在癌癥臨床治療中的應(yīng)用日漸廣泛，建立相應(yīng)的血藥濃度測(cè)定方法，進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，可以為臨床合理用藥提供有益的借鑒和依據(jù)，降低不良反應(yīng)的發(fā)生[3-4]。LC-MS/MS測(cè)定血漿中吉非替尼濃度的方法報(bào)道較多，具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，但儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本較高[5-8]。此外，采用HPLC測(cè)定血漿吉非替尼濃度的方法也有報(bào)道，但其樣品預(yù)處理較為繁瑣，對(duì)精密度和準(zhǔn)確度的影響較大[9]。本實(shí)驗(yàn)擬使用操作較為簡(jiǎn)便、成本低廉的乙腈蛋白沉淀樣品的預(yù)處理方法，減少血漿樣品用量，在保證檢測(cè)靈敏度的前提下，采用HPLC方法建立滿足靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度要求的吉非替尼血藥濃度測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（包括真空脫氣機(jī)，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器）；METTLER AE200型電子分析天平（瑞士梅特勒）；80-2型離心沉淀器（金壇市金南儀器廠）；VORTEX-5型渦旋器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

吉非替尼對(duì)照品（南京安格醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)20111015）；內(nèi)標(biāo)：厄洛替尼（南京安格醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào) 20111208）；空白血漿（北京市紅十字血液中心）；甲醇（色譜純，Burdick & Jackson）；乙腈（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；醋酸銨（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；水為去離子水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨溶液（70∶30）；檢測(cè)波長(zhǎng)：331 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：室溫；分析時(shí)間：12 min。

2.2 溶液的配制

精密稱取吉非替尼對(duì)照品44.69 mg，置25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.788 mg·mL-1儲(chǔ)備液，于4 ℃儲(chǔ)存。取儲(chǔ)備液，加乙腈稀釋，制成893.8 μg·mL-1工作液，同法配制715.0 μg·mL-1質(zhì)量控制工作液。

精密稱取厄洛替尼對(duì)照品23.84 mg，置50 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得476.8 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于4 ℃儲(chǔ)存。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，加乙腈稀釋，制成4.768 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 血漿樣品的預(yù)處理

將血漿樣品于37 ℃水浴解凍，精密吸取100 μL，置1.5 mL離心管中，加入4.768 μg·mL-1厄洛替尼溶液50 μL，混勻，再加入乙腈50 μL沉淀蛋白，混勻，4000 r·min-1離心10 min。取上層清液0.45 μm濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)控用血漿的制備

將893.8 μg·mL-1吉非替尼工作液用空白血漿逐級(jí)稀釋，制成濃度為89.38，178.8，357.5，893.8，1788，3575，8938 ng·mL-1對(duì)照品系列血漿。同法，將715.0 μg·mL-1的質(zhì)量控制工作液用空白血漿逐級(jí)稀釋制成143.0，715.0，7150 ng·mL-1的低、中、高3種指定濃度的質(zhì)量控制樣品，考察方法學(xué)的各項(xiàng)指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 吉非替尼的色譜分離

按照“2.1”項(xiàng)和“2.3”項(xiàng)所述方法處理并測(cè)定，空白血漿、空白血漿加厄洛替尼、空白血漿加吉非替尼對(duì)照品及厄洛替尼的樣品色譜圖見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，在選定的色譜條件下，厄洛替尼與吉非替尼的保留時(shí)間分別為4.5 min和9.1 min。血漿中吉非替尼及厄洛替尼出峰處的本底及其他雜質(zhì)的色譜峰對(duì)測(cè)定沒(méi)有任何干擾，具有良好的特異性和分離度。

3.2 線性關(guān)系考察

圖1 血漿樣品的HPLC色譜圖A-空白血漿；B-空白血漿加入厄洛替尼；C-空白血漿加入吉非替尼對(duì)照品和厄洛替尼；Ⅰ- 厄洛替尼（內(nèi)標(biāo)）；Ⅱ- 吉非替尼Fig 1 HPLC chromatograms of human plasma samplesA-blank plasma; B-blank plasma spiked with erlotinib; C-blank plasma spiked with gefitinib and erlotinib;Ⅰ- erlotinib (IS); Ⅱ-gefitinib

在89.38～8938 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，血漿中吉非替尼濃度（Y）與吉非替尼峰面積及厄洛替尼峰面積的比值（X）具有良好的線性關(guān)系。在精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)中制得的3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，r＞ 0.999。第1天的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y= 3 516.89X-7.95（r= 0.999 9）。

3.3 日內(nèi)與日間精密度和準(zhǔn)確度

取“2.4”項(xiàng)中配制的低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品各5份，按照“2.3”項(xiàng)和“2.1”項(xiàng)方法處理并測(cè)定，考察日內(nèi)的準(zhǔn)確度（RE）和精密度（RSD）（n= 5）；同法操作連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間的RE和RSD（n= 3）。按照隨行的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，計(jì)算吉非替尼的濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.4 定量下限

按“2.4”項(xiàng)下方法配制5份89.38 ng·mL-1的吉非替尼對(duì)照品血漿，按照“2.3”項(xiàng)和“2.1”項(xiàng)方法處理并測(cè)定。由隨行處理的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，計(jì)算RE和RSD。結(jié)果信噪比＞ 5，表明本法的信噪比良好。最低定量濃度的RE（n= 5）為- 1.81%，RSD（n=5）為3.09%，完全滿足此濃度下定量分析的要求。

表1 人血漿中吉非替尼的RE與RSDTab 1 REs and RSDs of gefitinib in human plasma samples

3.5 提取回收率

取“2.4”項(xiàng)中配制的低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)和“2.1”項(xiàng)方法處理并測(cè)定其中吉非替尼的峰面積。另外，取吉非替尼工作液，加乙腈逐級(jí)稀釋，制成相應(yīng)濃度的吉非替尼溶液，按“2.1”項(xiàng)方法測(cè)定吉非替尼的峰面積。將上述低、中、高3種濃度溶液的對(duì)應(yīng)峰面積值進(jìn)行比較，計(jì)算吉非替尼的提取回收率。血漿中吉非替尼在低、中、高3種濃度的提取回收率（n= 5），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 人血漿中吉非替尼的回收率.n = 5Tab 2 Recovery of gefitinib in human plasma samples.n = 5

3.6 樣品穩(wěn)定性

3.6.1 凍融穩(wěn)定性 取低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品各5份，經(jīng)過(guò)3次反復(fù)凍融（- 20～37 ℃）處理后測(cè)定吉非替尼的峰面積。利用未經(jīng)凍融處理，新建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，結(jié)果測(cè)定值與理論值的偏差為- 13.60% ～-10.30%（n= 5）。

3.6.2 低溫放置穩(wěn)定性 取低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品各5份，處理后在低溫（4 ℃）冷藏放置24 h后進(jìn)樣測(cè)定吉非替尼的峰面積。利用新建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，結(jié)果測(cè)定值與理論值的偏差為- 7.21% ～- 0.75%（n= 5）。

3.6.3 室溫放置穩(wěn)定性 取低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品各5份，在室溫下（25 ℃）放置24 h后，進(jìn)行處理、進(jìn)樣測(cè)定吉非替尼的峰面積。利用新建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，結(jié)果測(cè)定值與理論值的偏差為- 12.96% ～-8.97%（n= 5）。

結(jié)果顯示，在反復(fù)凍融3次、低溫冷藏、室溫放置等3種儲(chǔ)存條件下，樣品的測(cè)定值與理論值的偏差均符合要求，表明樣品在這些條件下的穩(wěn)定性良好。

4 討論

在確定色譜條件的過(guò)程中，我們對(duì)流動(dòng)相的組成和比例進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。嘗試采用甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，均無(wú)法避免吉非替尼色譜峰的拖尾現(xiàn)象。另外，在流動(dòng)相中增加冰醋酸的含量，通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值對(duì)改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象仍不理想。最后，采用甲醇-醋酸銨作為流動(dòng)相體系，可以取得滿意的色譜峰形及合適的分離效果。此外，通過(guò)比較1，10，20 mmol·L-1等不同濃度醋酸銨對(duì)分離的影響，確定甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨為最優(yōu)的流動(dòng)相體系。

在血漿樣品預(yù)處理的優(yōu)化過(guò)程中，比較甲醇和乙腈的血漿蛋白沉淀效果。在加入相同體積沉淀試劑的情況下，乙腈的處理效果明顯好于甲醇，同時(shí)可以保證較高的檢測(cè)靈敏度，滿足人血漿中低濃度吉非替尼的測(cè)定。此外，使用乙腈直接沉淀蛋白法處理樣品，簡(jiǎn)便快捷，成本低廉，能夠滿足分析要求，與其他方法相比，便于操作，易于推廣，可滿足大批量樣品測(cè)定的要求。

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