骨肉瘤組織中Skp2、p27蛋白的表達(dá)變化及意義

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

Skp2是細(xì)胞增殖的重要調(diào)控蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Skp2表達(dá)與大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系。p27為一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要抑癌基因，其通過(guò)調(diào)控活化細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶-2所需的細(xì)胞周期素E的閾值來(lái)抑制細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)［1］，Skp2和p27蛋白在惡性腫瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者從相反方面調(diào)控細(xì)胞周期素激酶活性。2008年6月～2011年6月，本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)了人骨肉瘤組織及正常骨組織中的Skp2和p27蛋白，探討兩者在骨肉瘤中的表達(dá)特點(diǎn)及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤組40例均為河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院手術(shù)切除并病理存檔的骨肉瘤石蠟標(biāo)本?；颊咧心?7例，女13例，年齡11～39歲，平均21歲。其中成骨肉瘤30例，軟骨肉瘤10例;低分化16例，高分化24例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。所有病例術(shù)前均未接受放化療。另選40例正常骨組織為對(duì)照組，均來(lái)源于手術(shù)治療的骨折患者，患者中男30例，女10例，年齡13～42歲，平均23歲。兩組患者性別、年齡相比，P均＞0.05。

1.2 主要試劑 鼠抗人Skp2和p27單克隆抗體，免疫組化染色試劑盒(SP盒)及DAB-HCL顯色試劑盒。

1.3 Skp2和p27蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化SP法。每例石蠟標(biāo)本以4 μm切片，常規(guī)脫蠟，微波修復(fù)抗原，3%H2O2處理10 min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。正常羊血清處理15 min，一抗4℃孵育過(guò)夜，生物素標(biāo)記的二抗處理15 min，鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶復(fù)合物處理15 min，DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知免疫組化陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者為Skp2和p27蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，顯微鏡下(×40)觀察，每片選8個(gè)不重復(fù)的高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，取其均值。以陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥25%為Skp2、p27蛋白表達(dá)陽(yáng)性、＜25%為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用四格表法進(jìn)行相關(guān)性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組與對(duì)照組Skp2、p27蛋白表達(dá)比較骨肉瘤組中Skp2蛋白表達(dá)陽(yáng)性27例，p27蛋白陽(yáng)性12例，對(duì)照組中分別為13、25例，兩組相比，P均＜0.05。

2.2 Skp2、p27蛋白表達(dá)與骨肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Skp2蛋白表達(dá)與骨肉瘤組織類(lèi)型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05);p27蛋白表達(dá)與骨肉瘤組織類(lèi)型、分化程度有關(guān)(P均＜0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P＞0.05)。詳見(jiàn)表1。

2.3 骨肉瘤組織中Skp2、p27蛋白表達(dá)的相關(guān)性骨肉瘤組織Skp2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的27例中，有p27蛋白陽(yáng)性12例(陽(yáng)性符合率為44.4%);Skp2蛋白表達(dá)陰性13例中，有p27蛋白陰性2例(陰性符合率為15.4%)，Skp2、p27蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= －0.34，P＜0.05)。

3 討論

Skp2是一種F-box蛋白，有四個(gè)亞單位，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S期過(guò)渡的關(guān)鍵。Skp2的過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，而缺乏則可對(duì)腫瘤起到抑制作用［2］。Skp2通過(guò)G/S轉(zhuǎn)換“關(guān)卡”促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展［3］，從而促進(jìn)DNA的復(fù)制、細(xì)胞增殖，因此Skp2基因被認(rèn)為是一種原癌基因，具有癌基因功能。Skp2應(yīng)用于人類(lèi)腫瘤檢測(cè)時(shí)，是不良預(yù)后的標(biāo)志之一。其作為F-box蛋白成員之一，在人感細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)復(fù)合體中能夠特異識(shí)別蛋白底物，降低細(xì)胞周期蛋白p27、p21等的表達(dá)，使S期細(xì)胞增加，抗凋亡能力增強(qiáng)［4］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Skp2陽(yáng)性表達(dá)者與陰性表達(dá)者相比，惡性腫瘤進(jìn)展更快，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，并且預(yù)后差，因此認(rèn)為Skp2可作為評(píng)估惡性腫瘤預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)記［5］。本研究結(jié)果也顯示，Skp2在骨肉瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率較正常骨組織明顯升高。

表1 Skp2、p27蛋白表達(dá)與骨肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Skp2可通過(guò)泛素化或者降解底物如p27來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖［5］。研究表明，Skp2在腫瘤的移行、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到直接作用［6］。Skp2在單獨(dú)缺乏時(shí)不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但聯(lián)合缺乏腫瘤抑制蛋白(ARF)或磷酸酶抑癌基因(PTEN)時(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］。Skp2缺乏者腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移會(huì)受到嚴(yán)重影響，而Skp2高表達(dá)則可大大促進(jìn)細(xì)胞的移行和轉(zhuǎn)移。RAS基因同源基因A家族(RhoA)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。在Skp2缺乏的細(xì)胞，RhoA mRNA及蛋白水平都會(huì)極大降低，而在Skp2過(guò)度表達(dá)時(shí)RhoA mRNA及蛋白水平會(huì)相應(yīng)增加［8］，提示Skp2抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能是通過(guò)RhoA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究中，40例骨肉瘤患者中有27例Skp2表達(dá)陽(yáng)性，且其在成骨肉瘤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、低分化者中的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于軟骨肉瘤、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、高分化者，表明Skp2陽(yáng)性表達(dá)者腫瘤惡性程度高、進(jìn)展快，易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)并且預(yù)后差，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

p27是一種廣譜的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制蛋白［9］。作為一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要抑癌基因，它直接參與細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、分化等調(diào)控過(guò)程，其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂［10］。p27與細(xì)胞的分化有關(guān)，過(guò)度表達(dá)抑制細(xì)胞的分裂，表達(dá)不足促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［11］。研究表明，p27很少或不發(fā)生基因突變，對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控主要通過(guò)其蛋白的表達(dá)水平及活性改變。在多種腫瘤中可發(fā)現(xiàn)p27表達(dá)下降，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌。p27能通過(guò)抑制依賴(lài)細(xì)胞周期素激酶(如cdk-1、cdk-2和cdk-4/6)，抑制G0/G1的轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞增殖［12］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，部分惡性腫瘤組織中p27蛋白及其mRNA呈陰性表達(dá)，而其相應(yīng)正常組織及良性病變組織中p27多呈陽(yáng)性表達(dá)，這說(shuō)明p27高表達(dá)有助于抑制腫瘤的發(fā)生，低水平的p27與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)［13］。本研究40例骨肉瘤患者中有12例p27表達(dá)為陽(yáng)性，且其在惡性程度較低的軟骨肉瘤及高分化者中表達(dá)陽(yáng)性率更高，證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

大量研究表明Skp2與p27蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［14］，Skp2能夠降低p27蛋白表達(dá)，促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，抗細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，Skp2蛋白表達(dá)陽(yáng)性者中有p27蛋白陽(yáng)性12例(陽(yáng)性符合率為44.4%)，Skp2蛋白陰性者中有p27蛋白陰性2例(陰性符合率為15.4%)，Skp2、p27蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=－0.34，P＜0.05)，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致，提示Skp2—p27可能代表了一種致癌通路。由于Skp2在多種腫瘤組織中表達(dá)增高，針對(duì)Skp2的靶向治療將給許多腫瘤患者帶來(lái)希望［15］。近年來(lái)多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，應(yīng)用Skp2拮抗劑能使腫瘤細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生自噬、衰老等［16，17］。而p27在惡性腫瘤中低表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，提示針對(duì)Skp2和p27的靶向治療應(yīng)該是有效的。抑制或者敲除Skp2基因以提高p27蛋白的表達(dá)率，可抑制G1/S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制惡性腫瘤的進(jìn)展，已經(jīng)在一些惡性腫瘤的治療中得到了證實(shí)。因此，檢測(cè)Skp2和p27蛋白的表達(dá)對(duì)骨肉瘤患者腫瘤惡性程度的判斷、治療及預(yù)后具有重要意義。

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