一氧化氮及一氧化氮合酶在急性吸入高濃度氧大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用

周 海，潘曉軍，楊建平，郭成浩△

(1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，江蘇 蘇州 215006;2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250012;3徐州中心醫(yī)院麻醉科，江蘇 徐州 221009)

持續(xù)吸入高濃度氧通過(guò)體內(nèi)出現(xiàn)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)而導(dǎo)致肺損傷已有較多報(bào)道［1］。我們發(fā)現(xiàn)大鼠在吸入高氧4 h后即發(fā)生體內(nèi)抗氧化能力改變，引起肺組織出現(xiàn)形態(tài)變化，一定程度上解釋了臨床全麻期間病人雖短期持續(xù)吸入高濃度氧，仍會(huì)出現(xiàn)拔管困難的現(xiàn)象［2］。氧自由基及其衍生物與細(xì)胞凋亡(apoptosis)密切相關(guān)［3］，其中一氧化氮(nitric oxide，NO)尤為重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備大鼠高氧肺損傷模型，觀察高氧急性期時(shí)血漿NO水平、肺泡上皮細(xì)胞凋亡及NO合酶(NO synthase，NOS)活性及內(nèi)皮型 NOS(endothelium NOS，eNOS)和誘導(dǎo)型 NOS(inducible NOS，iNOS)蛋白表達(dá)情況，探討高氧急性期的各指標(biāo)的關(guān)系以探討肺損傷的機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物模型的制備

1.1 動(dòng)物的選擇和分組 2月齡Wistar大鼠60只，體重150～200 g，由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為5組:正常氧對(duì)照組、高氧4 h組、高氧8 h組、高氧12 h組、高氧16 h組，每組12只，雌雄各半。

1.2 動(dòng)物模型的建立 采用聚乙烯箱和玻璃自制氧箱，尺寸為50 cm×30 cm×20 cm，為避免箱體內(nèi)形成高壓，箱體前后設(shè)有進(jìn)氣口和出氣口，應(yīng)用氣體流量計(jì)測(cè)定調(diào)整進(jìn)出口大小和氧氣流速，使氧箱進(jìn)出氣流量相同。每2 h應(yīng)用OX－100A型數(shù)字測(cè)氧儀檢測(cè)1次箱內(nèi)氧濃度，使氧濃度保持在85%以上。箱內(nèi)放置鈉石灰吸收CO2，保持CO2濃度不高于5%。對(duì)照組大鼠放置于敞開(kāi)的未通入氧氣的氧箱中。保持實(shí)驗(yàn)室溫度在20～28℃，每天白晝時(shí)間12 h，各組大鼠都給予充足的食物和飲水，保持墊料清潔。由于實(shí)驗(yàn)用氧箱體積有限，每個(gè)箱中只能放置6只大鼠。

2 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

所有大鼠取標(biāo)本前禁食6 h(不禁水)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射麻醉藥物(氯胺酮0.1～0.15 mg/g、安定6～7.5 μg/g)，動(dòng)物麻醉后立即解剖經(jīng)腹靜脈抽取靜脈血5 mL放置抗凝試管中冷藏，3000 r/min離心10 min抽取血漿檢測(cè)。取大鼠左肺用4%中性甲醛液固定，右肺三葉稱(chēng)重，按1∶10加入0.15 mmol/L的冰氯化鉀勻漿溶液，高速勻漿機(jī)制漿(FSH－2A，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng))，－4℃ 1500 r/min離心(GL－20高速冷凍離心機(jī)，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)15 min后取上清液密閉保存在－20℃冰箱中待檢。

2.1 病理學(xué)檢查 24 h內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋。常規(guī)制片，HE染色后鏡下觀察細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)。按TACS原位凋亡測(cè)試試劑盒(TA4652，R＆B)說(shuō)明制片，作TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野。

2.2 丙二醛(malondialdehyde，MDA)、NO 含量和NOS活性測(cè)定 MDA測(cè)定試劑盒、NO測(cè)定試劑盒、NOS測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，操作方法按說(shuō)明書(shū)。用AV640可見(jiàn)光分光光度儀(Olympus)化學(xué)比色檢測(cè)肺勻漿液、血漿中的MDA、NO和NOS活性。

2.3 不同類(lèi)型的NOS含量測(cè)定 部分肺組織加入事先配置好的蛋白裂解液(RIPA+PMSF，PMSF最終濃度為1 mmol/L)，在冰上放置20～30 min后，以10000 r/min 4℃離心4 min，吸取上清(即所提取的總蛋白)檢測(cè)其濃度。采用聚丙烯酸銨凝膠電泳(SDS－PAGE)技術(shù)測(cè)定iNOS、eNOS的蛋白含量(轉(zhuǎn)膜儀，SDS－PAGE電泳儀為Bio－Rad產(chǎn)品)。常規(guī)制備凝膠并放入電泳槽中，檢測(cè)樣品量為30 μL(6 μL蛋白上樣緩沖液+24 μL總蛋白)，于100℃水浴鍋內(nèi)變性5 min后，取出放涼后加入樣品孔。恒壓90 V開(kāi)始電泳，待指示劑到達(dá)濃縮膠與分離膠交界處，將電壓提高至120 V。待指示劑到達(dá)膠底部時(shí)，停止電泳。將凝膠取出放置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中。對(duì)照蛋白marker，將含有目的條帶和β－actin蛋白的凝膠切下，剪取與凝膠相同大小的PVDF膜，后者先用甲醇浸泡30 s，然后置于緩沖液中浸泡15 min。剪取4塊與凝膠大小相同的濾紙，于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡15 min。按正極－濾紙－PVDF膜－凝膠－濾紙－負(fù)極的順序依次放置于半干轉(zhuǎn)膜儀上，電壓20 V，轉(zhuǎn)膜30 min。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉TBS液中于37℃封閉2 h。1∶1000稀釋抗β－actin單克隆抗體(武漢博士德公司)、1∶800稀釋的抗eNOS抗體和抗iNOS抗體(兔抗鼠，武漢博士德)和PVDF膜4℃下孵育過(guò)夜。充分洗膜3次后，將1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG 37℃孵育30 min。充分洗膜3次后，將PVDF膜取出放置在保鮮膜上。將2種顯色底物1∶1等體積混合后覆蓋在膜表面，用保鮮膜把膜包起來(lái)，放入暗匣中，在暗室中將X光片覆蓋在膜的表面，夾好暗匣，曝光后顯影、定影，觀察結(jié)果。由圖像分析系統(tǒng)(南京新飛達(dá)公司生產(chǎn))，掃描測(cè)定吸光度(A)定量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 各組大鼠血漿、肺組織勻漿生化指標(biāo)

與對(duì)照組比較，無(wú)論是血漿還是肺組織勻漿中，高氧各組MDA濃度、NO濃度和NOS活性均顯著升高(P ＜0.01)，見(jiàn)表1。

2 Western印跡及吸光度分析結(jié)果

eNOS在對(duì)照組明顯表達(dá)，高氧4 h組表達(dá)開(kāi)始升高，8 h組后eNOS蛋白質(zhì)表達(dá)升高明顯。對(duì)照組iNOS蛋白微量表達(dá)，但表達(dá)量遠(yuǎn)低于eNOS，16 h組表達(dá)略增強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化

圖2顯示，高氧4 h組肺毛細(xì)血管有輕度充血和中性粒細(xì)胞滲出;8 h組可見(jiàn)肺毛細(xì)血管擴(kuò)張，充血明顯，肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞滲出，肺泡腔有少量紅細(xì)胞滲出;12 h組肺小血管擴(kuò)張、充血，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)紅細(xì)胞及以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞，肺組織水腫明顯，間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞增多;16 h組可見(jiàn)肺大泡和肺不張，并存在肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁輕度增厚。

4 各組大鼠肺泡上皮細(xì)胞TUNEL染色切片

圖3顯示4 h組肺泡上皮細(xì)胞凋亡明顯增加，達(dá)9.13%±3.20%，表現(xiàn)為淺綠色的核背景下有棕褐色小顆?；驂K狀物，正常細(xì)胞核被染成淺綠色;8 h組、12 h組凋亡細(xì)胞增加更加明顯，達(dá)17.47% ±3.50%、19.22% ±4.50%。16 h組明顯下降至11.03% ±2.80%，其中12 h組和16 h組核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色團(tuán)快，呈現(xiàn)DNA碎片凝集現(xiàn)象。各高氧組與對(duì)照組(凋亡細(xì)胞占2.17% ±1.80%)比較差異顯著(P ＜0.01)。

5 各組大鼠血漿及肺MDA、NO和NOS與肺泡上皮細(xì)胞凋亡的線(xiàn)性相關(guān)分析

隨吸氧時(shí)間延長(zhǎng)，各高氧組血漿及肺組織各指標(biāo)與肺泡上皮細(xì)胞凋亡呈明顯的正相關(guān)，見(jiàn)表2。

表1 急性吸氧對(duì)大鼠血漿及肺MDA濃度、NO濃度和NOS活性的影響Table 1.MDA concentration，NO concentration and NOS activity in plasma and lung tissues of the rats exposed to acute hyperoxia(.n=12)

表1 急性吸氧對(duì)大鼠血漿及肺MDA濃度、NO濃度和NOS活性的影響Table 1.MDA concentration，NO concentration and NOS activity in plasma and lung tissues of the rats exposed to acute hyperoxia(.n=12)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

MDA NO NOS Group Plasma(nmol/L) Lung(μmol/g protein) Plasma(μmol/L) Lung(mmol/g protein) Plasma(103U/L) Lung(103U/g protein)Control 4.43±1.77 1.87±0.51 16.01±2.43 5.17±1.43 16.01±2.48 0.94±0.13 Hyperxia 4 h 6.31±0.77＊＊ 3.24±0.43＊＊ 18.97±2.44＊＊ 12.00±2.51＊＊ 18.97±2.37＊＊ 1.77±0.34＊＊Hyperxia 8 h 9.43±1.34＊＊ 3.91±0.50 ＊＊ 21.04±4.75＊＊ 13.50±2.74 ＊＊ 20.17±3.22＊＊ 1.98±0.31＊＊Hyperxia 12 h 11.70±2.14＊＊ 4.81±0.50＊＊ 22.17±2.97＊＊ 14.90±3.52＊＊ 21.08±2.01＊＊ 2.24±0.45＊＊Hyperxia 16 h 13.67±1.83＊＊ 5.81±0.70 ＊＊ 22.89±3.01＊＊ 15.60±3.46＊＊ 21.84±1.97＊＊ 2.32±0.67＊＊

Figure 1.eNOS and iNOS expression in the lung of rats exposed to acute hyperoxia..n=6.＊＊P＜0.01 vs control.圖1 急性吸氧大鼠肺組織eNOS和iNOS的表達(dá)

討 論

吸氧是臨床有效的治療手段，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生，應(yīng)注意老幼病人的長(zhǎng)期應(yīng)用適應(yīng)癥［1］。臨床吸氧濃度大于50%即稱(chēng)為高濃度氧療［4］，特別臨床全麻期間病人需要持續(xù)吸入85% ～100%高濃度氧，麻醉吸氧時(shí)間雖不長(zhǎng)，但有時(shí)會(huì)碰到不明原因的拔管困難病例，這使得我們考慮急性高氧吸入是否造成肺損傷問(wèn)題，我們?cè)谇捌诠ぷ靼l(fā)現(xiàn)急性高氧吸入4 h即可引起實(shí)驗(yàn)大鼠的氧化水平異常并出現(xiàn)肺損傷［2］。

Figure 2.Pathological changes of lung tissues in rats exposed to acute hyperoxia(HE staining，×400).Control group:normal lung;hyperoxia 4 h group:mild pulmonary congestion;hyperoxia 8 h group:dilated pulmonary capillaries，obvious congestion，obvious neutrophilic exudate in the pulmonary interstitium and a few red cell exudate in the alveolar space;hyperoxia 12 h group:more red cell and neutrophilic exudate in the alveolar space;hyperoxia 16 h group:big bubble，atelectasis and mild alveolar wall thickening.圖2 急性吸氧大鼠肺組織病理變化

Figure 3.Apoptosis of alveolar epithelial cells in rats exposed to acute hyperoxia(TUNEL，×400).圖3 急性吸氧大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡的情況

表2 各高氧組大鼠血漿及肺MDA、NO和NOS與肺泡上皮細(xì)胞凋亡的線(xiàn)性相關(guān)分析Table 2.Linear correlation coefficients between MDA concentration，NO concentration and NOS activity in plasma and lung tissues，and apoptosis of alveolar epithelial cells in rats exposed to acute hyperoxia(.n=12)

表2 各高氧組大鼠血漿及肺MDA、NO和NOS與肺泡上皮細(xì)胞凋亡的線(xiàn)性相關(guān)分析Table 2.Linear correlation coefficients between MDA concentration，NO concentration and NOS activity in plasma and lung tissues，and apoptosis of alveolar epithelial cells in rats exposed to acute hyperoxia(.n=12)

MDA NO NOS Plasma Lung Plasma Lung Plasma Lung Apoptosis 0.99 0.99 0.99 0.99 0.95 0.99

機(jī)體內(nèi)活性氧－抗氧化系統(tǒng)平衡的破壞是高氧造成肺損傷的主要原因。NO既是一種生物信使分子和細(xì)胞毒性效應(yīng)分子，又是重要的自由基。正常生理?xiàng)l件下，NO作為內(nèi)皮舒張因子，參與組織和細(xì)胞的血液供應(yīng)，但在氧化應(yīng)急狀態(tài)下，NO可與SOD有力地競(jìng)爭(zhēng)O2－而形成強(qiáng)氧化劑ONOO－，即NO+，ONOO－可使細(xì)胞內(nèi)許多重要的蛋白質(zhì)或酶失活，破壞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)，使DNA鏈斷裂，并可啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化［3，6－7］，引起細(xì)胞壞死或凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高氧吸入4 h后，大鼠血漿及肺組織MDA、NO和NOS水平就出現(xiàn)異常，同時(shí)形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡開(kāi)始增加，且具有隨吸氧時(shí)間延長(zhǎng)肺組織形態(tài)變化加重的趨勢(shì)，在16 h后開(kāi)始恢復(fù)。提示吸入高濃度氧4 h體內(nèi)NOS活性即已上調(diào)，NO生成增加，說(shuō)明吸氧早期NO平衡已打破，NO及其衍生物在誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡和其它肺部形態(tài)改變中可能發(fā)揮了重要的介導(dǎo)作用。有報(bào)道高氧通過(guò)MAPKs通路導(dǎo)致肺泡上皮凋亡［8］。

NO可由位于血管內(nèi)皮的eNOS、白細(xì)胞的iNOS和神經(jīng)元的nNOS合成并分泌，有研究發(fā)現(xiàn)高氧條件下3 d后小鼠肺內(nèi)iNOS和eNOS表達(dá)及其活性上調(diào)，NO生成增加［5］，提示NO可能參與介導(dǎo)高氧性肺損傷。本實(shí)驗(yàn)Western blotting結(jié)果顯示，正常肺組織主要表達(dá)eNOS，而iNOS較少表達(dá);而高氧吸入4 h后，肺組織中主要是eNOS顯著升高，而iNOS變化不大，僅在16 h有輕微升高，說(shuō)明在急性高氧吸入時(shí)肺中的NO來(lái)源還是以eNOS合成的NO為主。

但細(xì)胞遭受應(yīng)激損傷時(shí)，并不一定耗盡了胞內(nèi)的SOD等抗氧化劑，而是微妙地調(diào)節(jié)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［8－9］，從而導(dǎo)致凋亡等細(xì)胞損傷出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)形態(tài)研究表明，在急性高氧刺激下，隨時(shí)間延續(xù)，肺組織表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增加，伴有少量炎細(xì)胞滲出。細(xì)胞凋亡研究顯示，4 h組肺泡上皮細(xì)胞凋亡明顯增加;8 h組、12 h組凋亡細(xì)胞增加更加明顯。而16 h組細(xì)胞凋亡明顯下降，提示在急性高氧損傷過(guò)程中，在16 h時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡減少，可能是值得深入研究的問(wèn)題。我們分析急性高氧不僅促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡的增加，也促進(jìn)肺毛細(xì)血管壁的通透性的增加，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致白細(xì)胞滲出，但并沒(méi)有到使白細(xì)胞功能激活的程度，因?yàn)閕NOS并沒(méi)有很高的表達(dá)，肺部損傷病變處于容易恢復(fù)的狀態(tài)。同時(shí)機(jī)體有強(qiáng)大的調(diào)整能力，在16 h時(shí)，可能已經(jīng)開(kāi)始恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)采用的高濃度氧與全麻吸入氧濃度相同，吸氧4～8 h也與全麻時(shí)間接近。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示急性高氧肺損傷模型中NO及其衍生物在誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡和其它肺部形態(tài)改變中可能發(fā)揮了重要作用，同時(shí)提示臨床全麻期間吸入高濃度氧的安全性值得進(jìn)一步研究。

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