Bcl-2、CytC和caspase-3在實(shí)驗(yàn)性精索靜脈曲張大鼠生精細(xì)胞中的表達(dá)及意義

成建軍 張雁鋼 李超鵬

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山西大醫(yī)院，山西 太原 030001

精索靜脈曲張（varicocele，VC）即精索內(nèi)蔓狀靜脈叢呈不同程度的擴(kuò)張和迂曲，是青年男性泌尿科常見疾病，發(fā)病率約15%（8%～20%）。發(fā)病以左側(cè)為主，占70%以上，是引起男性不育的重要原因之一。目前對于VC導(dǎo)致不育的研究主要集中在睪丸局部缺氧、代謝產(chǎn)物返流等方面[1]。但VC導(dǎo)致男性不育的確切機(jī)制仍然存在較大爭議。本實(shí)驗(yàn)通過探討B(tài)cl-2、細(xì)胞色素C（CytC）和caspase-3在精索靜脈曲張大鼠生精細(xì)胞中的表達(dá)及三者與睪丸組織凋亡的關(guān)系，期望得到VC導(dǎo)致男性不育的凋亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 模型的建立和分組

雄性Wistar大鼠72只，鼠齡為6周，體重115～135 g。72只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，分別為A1組、A2組、A3組、B1組、B2組、B3組；A1組、A2組和 A3組為實(shí)驗(yàn)組，B1組、B2組和B3組為對照組。選取36只大鼠建立ELV模型，36只行對照手術(shù)。模型建立方法：將左腎靜脈與0.55 mm的自制金屬桿一起結(jié)扎，造成左腎靜脈狹窄，可使左腎靜脈直徑縮小約一半，建立青春期大鼠實(shí)驗(yàn)性左側(cè)精索靜脈曲張（experimental left varicocele，ELV）模型。對照組游離左腎靜脈，但不結(jié)扎。術(shù)后2、4、8周，分別取造模成功的大鼠（實(shí)驗(yàn)組6只及對照組6只），并取左側(cè)睪丸。以精索靜脈直徑大于1 mm、左腎無萎縮為模型建立的標(biāo)準(zhǔn)。其中8周（A3）實(shí)驗(yàn)組未達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的動(dòng)物模型數(shù)，造模成功5例；由A1及A2組剩余模型飼養(yǎng)達(dá)8周時(shí)隨機(jī)取1例補(bǔ)充。

1.2 標(biāo)本采集

模型大鼠及對照組大鼠的左側(cè)睪丸組織，用福爾馬林液浸泡48 h，包埋蠟塊。

1.3 標(biāo)本處理

1.3.1 HE染色 5μm厚度切片，脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色后封片。

1.3.2 免疫組化 切片厚度5μm，采用SP法檢測，一抗、SP試劑盒和DAB顯色劑購自博奧森生物公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。細(xì)胞成分呈棕黃色為陽性表達(dá)。陰性對照步驟同實(shí)驗(yàn)組，其中由PBS代替一抗。用顯微鏡觀察并拍照免疫組化切片，用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析Bcl-2、CytC和caspase-3在大鼠睪丸組織中的表達(dá)，并測量陽性細(xì)胞平均灰度值。平均灰度值越低，免疫反應(yīng)陽性越強(qiáng)。

1.3.3 TUNEL 切取5μm厚睪丸組織石蠟切片，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按北京中山金橋公司提供的試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核染成棕色者為TUNEL陽性細(xì)胞，光鏡下（×400）每張切片選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算生精細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞所占百分率，作為生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)（AI）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩間的比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

對照組睪丸生精上皮完整，各級(jí)生精細(xì)胞及精子排列有序。ELV 2周組無明顯變化。ELV 4周組睪丸生精細(xì)胞上皮變薄，不完整，曲細(xì)精管管腔增大，精子明顯減少，各級(jí)生精細(xì)胞減少，并可見一些細(xì)胞的染色質(zhì)邊集化，呈環(huán)狀。ELV 8周組生精上皮基膜破裂，一些曲細(xì)精管中出現(xiàn)“多核巨細(xì)胞”（multinucleated giant cells），即多個(gè)細(xì)胞核聚集形成一個(gè)大的細(xì)胞團(tuán)塊，其中一些細(xì)胞核染色質(zhì)明顯邊集化，呈環(huán)狀，間質(zhì)細(xì)胞水腫增大。

2.2 免疫組化

Bcl-2、CytC和caspase-3蛋白在實(shí)驗(yàn)組和對照組的各級(jí)生精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可見到表達(dá)，陽性結(jié)果均為棕黃色物質(zhì)分布。兩組的平均灰度值見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組、對照組免疫組化平均灰度值（）

表1 實(shí)驗(yàn)組、對照組免疫組化平均灰度值（）

注：與對照組相同時(shí)間段比較，◆P＜0.05；與本組2周時(shí)比較，▲P＜0.05；與本組4周時(shí)比較，★P＜0.05

組別 只數(shù)Bcl-2 CytC caspase-3實(shí)驗(yàn)組2周4周8周對照組2周4周8周6 6 6 6 6 6 113.14±10.15 141.56±6.16◆▲152.28±4.97◆▲★161.02±8.74 149.86±3.97◆▲138.69±8.08◆▲★162.38±7.85 140.44±6.81◆▲129.04±6.66◆▲★113.06±5.12 114.96±12.20 110.81±4.79 163.56±6.34 161.30±3.41 159.38±2.57 168.75±8.00 170.68±6.87 171.47±7.17

2.3 TUNEL法檢測凋亡

對照組中可見少量細(xì)胞凋亡細(xì)胞，主要集中在次級(jí)精母細(xì)胞及分裂期的精子細(xì)胞。2周實(shí)驗(yàn)組可見極少量生精細(xì)胞細(xì)胞凋亡；4周實(shí)驗(yàn)組可見曲細(xì)精小管中各級(jí)生精細(xì)胞較對照組及2周實(shí)驗(yàn)組凋亡增加；8周實(shí)驗(yàn)組可見曲細(xì)精小管中各級(jí)生精細(xì)胞大量凋亡，管腔變薄，管腔中可見大量凋亡的分裂晚期的精子細(xì)胞。見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組和對照組凋亡指數(shù)（%）

3 討論

細(xì)胞凋亡又叫程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在一系列內(nèi)源性基因的調(diào)控下發(fā)生的自然或生理性死亡的過程。細(xì)胞凋亡過程是受基因的精確調(diào)控而完成的，其具體的過程機(jī)制尚不明確，Bcl-2是一種細(xì)胞膜蛋白，主要存在于線粒體膜、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上[2]，高水平的Bcl-2蛋白有抑制細(xì)胞死亡等作用，是細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白[3]。Tanaka等[4]證實(shí)Bcl-2能抑制睪丸生精細(xì)胞的凋亡和分化。CytC是一個(gè)線粒體起源的細(xì)胞凋亡信號(hào)，Bcl-2可通過抑制CytC從線粒體的釋放入細(xì)胞質(zhì)，而Bax、Bak可與Bcl-2結(jié)合，阻止其對CytC釋放孔道的抑制作用，從而促進(jìn)CytC從線粒體釋放，引起凋亡[5]。CytC通過接頭分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，是凋亡執(zhí)行的重要效應(yīng)分子。正常情況下，caspase-3以酶原的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，無活性，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，其被激活，而誘導(dǎo)凋亡[6]。caspase-3是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，它的活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[7]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ELV 2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對照組生精細(xì)胞凋亡指數(shù)比較未見明顯差異，實(shí)驗(yàn)組及對照組Bcl-2、CytC和caspase-3表達(dá)未見明顯變化。有實(shí)驗(yàn)表明VC對睪丸的損害隨時(shí)間進(jìn)展而累積[8]，此時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組凋亡指數(shù)無明顯差異可能是因?yàn)閂C對睪丸損害的累積效應(yīng)尚不足以誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡增加，或者睪丸組織通過多種機(jī)制產(chǎn)生代償作用降低了VC對睪丸損害的累積效應(yīng)使其不足以誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡增加。ELV 4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組生精細(xì)胞凋亡指數(shù)及CytC、caspase-3表達(dá)較對照組顯著升高，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2表達(dá)較對照組顯著降低?？梢婋S著睪丸損害的時(shí)間累積效應(yīng)增加，睪丸組織失代償導(dǎo)致睪丸生精細(xì)胞Bcl-2、CytC和caspase-3表達(dá)顯著變化，最終導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡增加。ELV 8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組生精細(xì)胞凋亡指數(shù)及CytC、caspase-3表達(dá)較ELV 4周組進(jìn)一步顯著升高，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2表達(dá)較ELV 4周組進(jìn)一步顯著下降?？梢婋S著睪丸損害時(shí)間累積效應(yīng)的增加，對睪丸生精細(xì)胞Bcl-2、CytC和caspase-3表達(dá)的影響進(jìn)一步增加、生精細(xì)胞損害較前進(jìn)一步加重。有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2通過干擾CytC的釋放阻斷caspase蛋白酶的激活，從而抑制凋亡[5],孫寶華等[9]發(fā)現(xiàn)Bcl-2不僅通過抑制CytC等進(jìn)而抑制caspase-3的活化，還參與抑制caspase-3的合成。本實(shí)驗(yàn)中Bcl-2與CytC、caspase-3的表達(dá)隨時(shí)間累積變化趨勢相反，且變化存在同步性，與孫寶華等的研究發(fā)現(xiàn)一致。

本試驗(yàn)中，ELV大鼠生精細(xì)胞Bcl-2表達(dá)隨時(shí)間顯著下降，CytC、caspase-3表達(dá)隨時(shí)間顯著升高，ELV大鼠生精細(xì)胞凋亡指數(shù)隨時(shí)間顯著增大；Bcl-2與CytC、caspase-3的表達(dá)變化呈現(xiàn)同步性且趨勢相反。可見，VC可通過多種機(jī)制影響B(tài)cl-2表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致CytC、caspase-3的表達(dá)變化，使大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡增加進(jìn)而影響大鼠的睪丸生精功能。

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