• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的篩選及其基因的克隆與表達(dá)

    2012-07-27 07:25:20王斌斌劉逸寒王建玲路福平
    化學(xué)與生物工程 2012年6期
    關(guān)鍵詞:糖苷酶菌體芽孢

    王斌斌,劉逸寒,李 玉,王建玲,路福平

    (工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗室(天津科技大學(xué)) 工業(yè)酶國家工程實(shí)驗室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457)

    β-葡萄糖苷酶(beta-Glucosedase,EC 3.2.1.21)是纖維素降解酶系的主要組分之一,它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵,同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[1],在人類、動物、植物和微生物的糖類代謝方面都具有重要的價值[2]。目前,β-葡萄糖苷酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、釀酒、醫(yī)藥、化工及糧食加工等領(lǐng)域,可用于改善茶葉、果汁的風(fēng)味[3],生產(chǎn)低聚龍膽糖[1]、大豆異黃酮活性苷元[4]和天然抗氧化劑多酚化合物[5]等。

    雖然植物中廣泛存在著β-葡萄糖苷酶,但其含量少、活力低、大規(guī)模生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶純化工藝較為復(fù)雜,限制了其擴(kuò)大應(yīng)用。因此,通過基因重組技術(shù)構(gòu)建工程菌,分泌表達(dá)高活性β-葡萄糖苷酶對其實(shí)現(xiàn)工業(yè)化具有重要意義。Raynal等[6]于1984年從脆壁克魯維酵母中克隆得到β-葡萄糖苷酶基因,并在大腸桿菌和釀酒酵母中表達(dá),重組菌產(chǎn)酶活力分別達(dá)到570 U·mL-1和3660 U·mL-1。2007年Hong等[7]在畢赤酵母中對嗜熱子囊菌β-葡萄糖苷酶進(jìn)行表達(dá),酶活力為0.7 U·mL-1。2009年李麗娟[8]實(shí)現(xiàn)黑曲霉GS115β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中表達(dá),酶活達(dá)到1218 U·mL-1,是出發(fā)菌株的33.6倍。迄今為止,已有多種微生物來源的β-葡萄糖苷酶基因被克隆獲得并實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)及分泌,但β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌的相關(guān)研究絕大部分集中于真菌[9],而對于細(xì)菌β-葡萄糖苷酶鮮有研究。隨著β-葡萄糖苷酶在化工以及其它領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌β-葡萄糖苷酶的優(yōu)勢逐漸凸顯出來[10,11],堿性和高溫的極端環(huán)境下真菌來源的酸性β-葡萄糖苷酶活力會急劇下降甚至喪失,而大多數(shù)細(xì)菌β-葡萄糖苷酶耐堿耐熱性能良好。因此,對細(xì)菌β-葡萄糖苷酶的研究成為主要發(fā)展趨勢。

    作者從濱海新區(qū)鹽堿地土壤中分離篩選得到一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的短小芽孢桿菌B-4,并成功實(shí)現(xiàn)其β-葡萄糖苷酶基因bglB在大腸桿菌中的表達(dá),為下一步該酶的性質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗

    1.1 土樣來源

    土樣采自天津濱海新區(qū)鹽堿地。

    1.2 質(zhì)粒與試劑

    E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET-22b(+),自行保存;克隆載體pUCm-T,TaKaRa公司。

    Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、純化DNA片段的瓊脂糖凝膠回收試劑盒,Takara公司;X-Gal、IPTG、T4連接酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),上海生物工程有限公司。引物合成及測序由上海Invitrogen生物公司完成。

    1.3 培養(yǎng)基

    菌種富集篩選培養(yǎng)基:蛋白胨 1%,牛肉膏 0.3%,NaCl 0.5%,纖維二糖 0.5%,納他霉素適量,pH值7.4~7.6,121 ℃滅菌20 min。

    產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基[12]:梔子苷 1‰,谷氨酸鈉 1%,蛋白胨 0.5%,KH2PO41%,MgSO40.05%,瓊脂 2%,pH值7.4~7.6,121 ℃滅菌20 min。

    產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基[13]:麩皮 4%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.2%,CaCl20.04%,MgSO4·7H2O 0.04%,121 ℃滅菌20 min。

    1.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶細(xì)菌的篩選

    1.4.1 初篩

    稱取1 g土樣加入到10 mL無菌水中,于80~90 ℃熱水浴中保溫10~15 min,37 ℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng),得到菌懸液;將菌懸液置于裝有菌種富集篩選培養(yǎng)基的三角瓶中于37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)2 d;梯度稀釋(10~106)[14],涂布于篩選培養(yǎng)基平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h,篩選單菌落周圍藍(lán)色水解圈顏色較深且與菌落直徑比值相對較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

    1.4.2 復(fù)篩

    將經(jīng)初篩獲得的單菌落接種于裝有富集篩選培養(yǎng)基的三角瓶中,于37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 h,按1%的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h。用DNS法測定其酶活,篩選獲得β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株。

    1.5 β-葡萄糖苷酶活性測定

    取0.5 mL粗酶液加入到1.5 mL緩沖溶液配制的0.5% PNPG溶液中,于50 ℃水浴15 min;加入1.5 mL DNS,沸水浴5 min;冷卻至室溫后用蒸餾水稀釋至20 mL,在波長540 nm處測定其吸光值(OD540)。

    酶活力單位定義為:每小時產(chǎn)生1 mg還原糖所需的酶量,用U·mL-1表示。

    1.6 菌株16S rDNA序列的擴(kuò)增、測定

    參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。所測細(xì)菌16S rDNA序列同GenBank數(shù)據(jù)庫相關(guān)菌株的16S rDNA序列比對,并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

    1.7 引物設(shè)計及目的片段的擴(kuò)增

    根據(jù)GenBank上已經(jīng)發(fā)表的短小芽孢桿菌SAFR-032β-葡萄糖苷酶基因序列bglB(登錄號為YP_001488769.1)設(shè)計上游引物:5′-CGCGGATCCATGAGGAGGGCATTCAACATGAACAA-3′(下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)),下游引物:5′-CCG-GAATTCTTATGCATCTAAATGATCACCATTTGTCG-3′(下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為:10×Taq緩沖溶液5 μL,模板DNA 1 μL,濃度為10 μmol·L-1的引物各2 μL,dNTPs(2.5 mmol·L-1)4 μL,Taq DNA聚合酶0.3 μL,超純水35.7 μL,混勻。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,53 ℃ 45 s,72 ℃ 2 min,32個循環(huán);72 ℃ 10 min。

    1.8 bglB基因的克隆及序列分析

    將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到pUCm-T載體上,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選獲得含bglB基因陽性克隆,經(jīng)測序后在NCBI與已有β-葡萄糖苷酶序列進(jìn)行比對分析。

    1.9 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-bglB的構(gòu)建

    將上述測序正確的質(zhì)粒及提取的大腸桿菌表達(dá)載體pET-22b(+)分別用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后,用T4連接酶于16 ℃連接過夜,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,氨芐抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子,分別用PCR和雙酶切法進(jìn)行鑒定,并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序。再將陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。

    1.10 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分析鑒定

    將構(gòu)建好的工程菌BL21/pET-bglB和對照菌BL21/pET-22b(+)分別接種于5 mL帶有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃水浴振蕩培養(yǎng)過夜,按1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有30 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8時,加入IPTG(終濃度為1 mmol·L-1),20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。16 h后,4000 r·min-1冷凍離心收集菌體,將菌體懸于pH值7.0的磷酸緩沖溶液中,冰浴超聲。超聲波功率為200 W,每超聲5 s間隔8 s,共70次。分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為5%),檢測蛋白的表達(dá)情況。按1.5方法,對重組菌株的酶活力進(jìn)行測定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的分離

    傳統(tǒng)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株篩選方法主要是在以纖維二糖為唯一碳源的平板上根據(jù)透明圈的大小進(jìn)行篩選,由于纖維二糖價格較為昂貴,進(jìn)行較大規(guī)模篩選成本較高。因梔子苷可被β-葡萄糖苷酶分解生成梔子苷元,而梔子苷元可與谷氨酸鈉作用形成藍(lán)色化合物,故可根據(jù)產(chǎn)生的藍(lán)色圈來篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。本實(shí)驗利用梔子苷篩選培養(yǎng)基獲得9株具有較高β-葡萄糖苷酶活力的菌株,見表1。

    表1 9株具有較高β-葡萄糖苷酶活性的菌株

    由表1可以看出,菌株B-4經(jīng)37 ℃培養(yǎng)后藍(lán)色圈直徑與菌落直徑的比值最大,且顏色最深,同時其經(jīng)進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)后具有最高的酶活,所以選用B-4作為后續(xù)實(shí)驗出發(fā)菌株。

    2.2 菌株B-4的形態(tài)(圖1)、16S rDNA鑒定

    圖1 B-4的菌落形態(tài)(a)和菌體形態(tài)(b)

    由圖1可以看出,菌落較小,呈乳白色,表面光滑,不透明;菌體呈短桿狀,很少成鏈,大小為(0.6~0.7)μm×(2.0~3.0)μm,具內(nèi)生芽孢,少有兩端生,為革蘭氏陽性菌。推測菌株B-4屬于芽孢桿菌。

    利用NCBI中的BLAST軟件對B-4菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn),菌株B-4與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)的同源性為99%。又根據(jù)同源序列搜索,并且下載一些相關(guān)菌種的16S rDNA序列,利用MEGA 4.0軟件來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)一步探索菌株B-4與短小芽孢桿菌的親緣關(guān)系,見圖2。

    圖2 菌株B-4 16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

    由圖2可以看出,菌株B-4與Bacilluspumilus處于同一分支,進(jìn)化距離最短,這與BLAST比對的結(jié)果一致。

    根據(jù)形態(tài)學(xué)、16S rDNA比對分析,可將菌株B-4鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。

    2.3 短小芽孢桿菌B-4 β-葡萄糖苷酶基因bglB的獲得

    利用PCR技術(shù)擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖如圖3所示。

    1.DNA標(biāo)準(zhǔn) 2.PCR產(chǎn)物

    由圖3可以看出,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增后,得到1.5 kb左右的產(chǎn)物,片段大小與目的基因bglB相符。

    2.4 bglB基因的序列測定與分析

    按照1.8方法進(jìn)行bglB的擴(kuò)增、連接、驗證和測序,其驗證結(jié)果見圖4。

    M.分子量標(biāo)記 1~5.pUCm-T-bglB/Bam HI+Eco RI

    序列分析結(jié)果表明,所得目的基因片段大小為1437 bp,可編碼478個氨基酸,目的蛋白大小預(yù)計為52.5 kD。將該基因的核苷酸序列與GenBank中序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),其與短小芽孢桿菌SAFR-032及枯草芽孢桿菌TU-B-10編碼的β-葡萄糖苷酶基因(YP_001488769.1、YP_004879524.1)具有較高的同源性,達(dá)到97%,其中與短小芽孢桿菌SAFR-032編碼基因相比,41個堿基不同,翻譯為蛋白質(zhì)后有6個氨基酸差異,氨基酸同源性達(dá)到99%。

    2.5 重組菌株BL21/pET-bglB的篩選與鑒定

    按照1.9方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-bglB,其雙酶切驗證結(jié)果見圖5。

    M.分子量標(biāo)記 1~4.pET-bglB/Bam HI+Eco RI

    由圖5可以看出,重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI及EcoRI雙酶切后,獲得的兩個特異性條帶大小分別與目的片段bglB及載體pET-22b(+)相符,表明重組菌株BL21/pET-bglB構(gòu)建成功。

    2.6 SDS-PAGE檢測

    將驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),以BL21/pET-22b(+)誘導(dǎo)、BL21/pET-bglB未誘導(dǎo)作為對照。分別對超聲破碎后的上清液、沉淀和全菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果見圖6。

    M.分子量標(biāo)記 1.BL21/pET-bglB未誘導(dǎo)全菌體 2.BL21/pET-22b(+)誘導(dǎo)后全菌體 3.BL21/pET-bglB誘導(dǎo)后上清 4.BL21/pET-bglB誘導(dǎo)后沉淀 5.BL21/pET-bglB誘導(dǎo)后全菌體

    由圖6可以看出,BL21/pET-bglB的上清、沉淀與全菌體中均發(fā)現(xiàn)有相對分子質(zhì)量約為58 kD的表達(dá)蛋白(條帶3~5),與理論值略有差異,這是由于pET-22b(+)質(zhì)粒本身分別帶有His標(biāo)簽序列,其編碼的蛋白與目的蛋白融合表達(dá)的結(jié)果。通過Band-scan軟件分析得到其表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的37.3%左右,經(jīng)超聲破碎后,蛋白仍有一部分以包涵體形式存在于沉淀中,上清中有部分蛋白表達(dá)。同時,按照1.5方法,測得BL21/pET-bglB超聲破碎上清液中β-葡萄糖苷酶BGL的酶活力可達(dá)46.85 U·mL-1。

    2.7 討論

    目前,由于由植物直接提取β-葡萄糖苷酶存在較多問題,微生物來源的β-葡萄糖苷酶受到廣泛重視。雖然微生物來源β-葡萄糖苷酶在許多催化性質(zhì)上都表現(xiàn)出一定的相似性,但與大部分真菌β-葡萄糖苷酶相比,細(xì)菌β-葡萄糖苷酶在最適pH值、等電點(diǎn)等方面均明顯不同,其在中性或堿性條件下具有更高的催化活性[16]。因此,從實(shí)際應(yīng)用方面考慮,有必要開發(fā)熱穩(wěn)定性好、pH值作用范圍寬的β-葡萄糖苷酶。

    3 結(jié)論

    從鹽堿地土壤中分離得到一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的短小芽孢桿菌B-4。其β-葡萄糖苷酶基因bglB大小為1437 bp,編碼478個氨基酸,與已報道短小芽孢桿菌SAFR-032β-葡萄糖苷酶基因(YP_001488769.1)核苷酸序列同源性為97%、氨基酸序列同源性為99%。進(jìn)一步利用表達(dá)載體pET-22b(+),實(shí)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶基因bglB在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達(dá),活力達(dá)46.85 U·mL-1。為下一步酶學(xué)特性的分析及結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)。

    [1] 潘利華,羅建平.β-葡萄糖苷酶的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].食品科學(xué),2006,27(12):803-807.

    [2] Amann R I,Ludwig W,Schleifer K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiological Reviews,1995,59(1):143-169.

    [3] 李平,宛曉春,陶文沂,等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的食品增香應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26(2):5-6.

    [4] Pyo Y H,Lee T C,Lee Y C.Enrichment of bioactive isoflavones in soymilk fermented withβ-glucosidase-producing lactic acid bacteria[J].Food Research International,2005,38(5):551-559.

    [5] Yan T R,Liau J C.Synthesis of alkylβ-glucosidase from cellobiose withAspergillusnigerβ-glucosidase Ⅱ[J].Biotechnology Letters,1998,20(7):653-657.

    [6] Raynal A,Guerineau M.Cloning and expression of the structural gene forβ-glucosidase ofKluyveromycesfragilisinEscherichiacoliandSaccharomycescerevisiae[J].Mol Gen Genet,1984,195(1-2):108-115.

    [7] Hong J,Tamaki H,Kumagai H.Cloning and functional expression of thermostableβ-glucosidase gene fromThermoascusaurantiacus[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,73(6):1331-1339.

    [8] 李麗娟.β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2009.

    [9] 李遠(yuǎn)華.β-葡萄糖苷酶的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,29(4):421-425.

    [10] 趙新剛.洗滌用堿性纖維素酶及其產(chǎn)生菌的分離方法[J].微生物學(xué)通報,1999,26(1):63-65.

    [11] 沈雪亮,夏黎明,劉景晶.纖維素酶E5基因在E.coli中的克隆與表達(dá)[J].浙江大學(xué)學(xué)報(工學(xué)版),2001,35(6):640-644.

    [12] 張蔚,楊雪鵬,魏東芝,等.β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].河南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,41(2):174-178.

    [13] 李平,宛曉春,陶文沂,等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000,27(2):196-198.

    [14] 吳小剛,曾瑩,周麗明,等.β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌的篩選[J].中國釀造,2005,(9):14-16.

    [15] 成堃,路福平,李玉,等.產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選、分子鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)的初步研究[J].中國釀造,2009,(2):33-36.

    [16] 房偉,方澤民,劉娟娟,等.新型海洋微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及重組酶性質(zhì)[J].生物工程學(xué)報,2009,25(12):1914-1920.

    猜你喜歡
    糖苷酶菌體芽孢
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    東北酸菜發(fā)酵過程中菌體的分離與鑒定
    解淀粉芽孢桿菌Lx-11
    解淀粉芽孢桿菌的作用及其產(chǎn)品開發(fā)
    側(cè)孢短芽孢桿菌A60
    知母中4種成分及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    木蝴蝶提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    黃芩苷對一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內(nèi)外抗菌作用的研究
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲avbb在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲情色 制服丝袜| 美女主播在线视频| av有码第一页| 国产真人三级小视频在线观看| 手机成人av网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99国产精品免费福利视频| tube8黄色片| 老司机靠b影院| 精品少妇内射三级| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲av国产av综合av卡| 国产成人精品在线电影| www.自偷自拍.com| 国产日韩欧美视频二区| 超碰成人久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费看十八禁软件| 香蕉丝袜av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲avbb在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 中文欧美无线码| 美女大奶头黄色视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲视频免费观看视频| 一区福利在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 精品人妻1区二区| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲伊人久久精品综合| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品久久久久久精品电影小说| 黄色毛片三级朝国网站| 国产亚洲欧美精品永久| 日本一区二区免费在线视频| 男女边摸边吃奶| 精品免费久久久久久久清纯 | 视频区欧美日本亚洲| 亚洲五月色婷婷综合| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 免费不卡黄色视频| 亚洲精华国产精华精| 欧美在线一区亚洲| 国产三级黄色录像| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲伊人色综图| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品免费视频内射| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99九九在线精品视频| 欧美大码av| 黑人猛操日本美女一级片| 性少妇av在线| 99久久国产精品久久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 男女免费视频国产| 国产精品九九99| 国产免费av片在线观看野外av| 日本五十路高清| 超碰97精品在线观看| 老司机影院成人| 色播在线永久视频| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜激情久久久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 男人操女人黄网站| 亚洲av国产av综合av卡| 伊人亚洲综合成人网| 国产成人精品久久二区二区91| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产伦人伦偷精品视频| 欧美97在线视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| videos熟女内射| 久久久久久久国产电影| 91字幕亚洲| 99久久人妻综合| 午夜免费成人在线视频| av天堂在线播放| 91字幕亚洲| 国产精品国产三级国产专区5o| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品国产综合久久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产高清videossex| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美一级毛片孕妇| 热99re8久久精品国产| 中国美女看黄片| 免费观看人在逋| 国产av精品麻豆| 女性生殖器流出的白浆| 黑丝袜美女国产一区| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲av电影在线进入| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 99九九在线精品视频| 真人做人爱边吃奶动态| 美女福利国产在线| 亚洲成人手机| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 青青草视频在线视频观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品卡一卡二卡四卡免费| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男男h啪啪无遮挡| 日日夜夜操网爽| av在线播放精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 波多野结衣一区麻豆| 一进一出抽搐动态| 国产亚洲欧美精品永久| 国产片内射在线| 青春草亚洲视频在线观看| 777米奇影视久久| 国产男女内射视频| 亚洲人成电影观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产免费av片在线观看野外av| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 大香蕉久久网| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品.久久久| 亚洲av电影在线进入| 狠狠狠狠99中文字幕| 电影成人av| 电影成人av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 99香蕉大伊视频| 亚洲精品乱久久久久久| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 正在播放国产对白刺激| 午夜免费鲁丝| 黑人操中国人逼视频| 欧美日韩精品网址| 一级a爱视频在线免费观看| 在线观看www视频免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 在线观看www视频免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 18禁观看日本| 国产野战对白在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美日韩黄片免| 丝袜脚勾引网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产人伦9x9x在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美日韩视频精品一区| 国产一区二区在线观看av| 黄色片一级片一级黄色片| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲第一青青草原| 亚洲精品粉嫩美女一区| 大陆偷拍与自拍| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一区在线观看完整版| 最新在线观看一区二区三区| 国产男女内射视频| 中文字幕av电影在线播放| 精品久久久精品久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 丝袜脚勾引网站| 18禁观看日本| 国产野战对白在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久av网站| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 波多野结衣一区麻豆| 亚洲精品第二区| 啦啦啦啦在线视频资源| av在线老鸭窝| 国产不卡av网站在线观看| 久久av网站| 亚洲九九香蕉| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 人人妻人人澡人人看| 色综合欧美亚洲国产小说| 多毛熟女@视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 国产亚洲精品第一综合不卡| 啦啦啦免费观看视频1| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美xxⅹ黑人| 最新的欧美精品一区二区| 性少妇av在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| av电影中文网址| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲全国av大片| 国产免费av片在线观看野外av| 五月开心婷婷网| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产高清国产精品国产三级| 在线观看舔阴道视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 老熟女久久久| 午夜福利,免费看| 亚洲七黄色美女视频| 两性夫妻黄色片| 99香蕉大伊视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久99热这里只频精品6学生| 美国免费a级毛片| 曰老女人黄片| 亚洲精品一区蜜桃| 国产一卡二卡三卡精品| 最近中文字幕2019免费版| 国产黄色免费在线视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 黑人猛操日本美女一级片| 午夜福利视频精品| 亚洲专区国产一区二区| 在线观看人妻少妇| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜久久久在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 飞空精品影院首页| 1024香蕉在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文字幕最新亚洲高清| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久久国产精品人妻一区二区| 精品人妻1区二区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久久久国内视频| 欧美中文综合在线视频| 亚洲专区字幕在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费在线观看完整版高清| 亚洲av日韩在线播放| 少妇人妻久久综合中文| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 女性被躁到高潮视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 黄片小视频在线播放| 亚洲精华国产精华精| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一区二区三区精品91| 国产男女内射视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品免费视频内射| 亚洲伊人色综图| h视频一区二区三区| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品欧美一区二区三区在线| 我的亚洲天堂| a级毛片黄视频| 丁香六月天网| 啦啦啦 在线观看视频| 十八禁人妻一区二区| svipshipincom国产片| 老司机亚洲免费影院| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费人妻精品一区二区三区视频| 高清av免费在线| 无限看片的www在线观看| 日本五十路高清| 啦啦啦 在线观看视频| 99香蕉大伊视频| 国产一区二区 视频在线| 亚洲专区国产一区二区| 国产在线观看jvid| 国产男女超爽视频在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品久久久久久电影网| 午夜成年电影在线免费观看| 91九色精品人成在线观看| av线在线观看网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| tocl精华| 免费在线观看日本一区| 少妇粗大呻吟视频| 91精品三级在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美精品av麻豆av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 1024香蕉在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品 欧美亚洲| 老司机影院成人| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 麻豆国产av国片精品| 国产精品欧美亚洲77777| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 波多野结衣av一区二区av| 最近中文字幕2019免费版| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲全国av大片| 美女高潮到喷水免费观看| 99热国产这里只有精品6| 久久 成人 亚洲| 国产精品久久久久久精品古装| 日本黄色日本黄色录像| 午夜精品久久久久久毛片777| 91精品伊人久久大香线蕉| 午夜视频精品福利| 国产成人精品在线电影| 少妇人妻久久综合中文| av不卡在线播放| 欧美精品高潮呻吟av久久| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲国产欧美在线一区| 色老头精品视频在线观看| h视频一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 中文字幕最新亚洲高清| 超碰97精品在线观看| 亚洲久久久国产精品| 久久香蕉激情| 亚洲 欧美一区二区三区| 岛国在线观看网站| 精品人妻在线不人妻| 免费观看a级毛片全部| 国产1区2区3区精品| 成人国产一区最新在线观看| 国产av精品麻豆| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| bbb黄色大片| 精品久久久精品久久久| 国产xxxxx性猛交| 国产黄色免费在线视频| 91老司机精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲成国产人片在线观看| 9热在线视频观看99| a级片在线免费高清观看视频| 男人操女人黄网站| 真人做人爱边吃奶动态| 国产淫语在线视频| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲中文日韩欧美视频| 丝袜喷水一区| 天天操日日干夜夜撸| 久久青草综合色| 国产不卡av网站在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 在线 av 中文字幕| 国产欧美亚洲国产| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产一级毛片在线| 亚洲精品美女久久av网站| 国产麻豆69| 女性被躁到高潮视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 男女边摸边吃奶| 国产99久久九九免费精品| 亚洲少妇的诱惑av| 人成视频在线观看免费观看| 男女国产视频网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 69精品国产乱码久久久| 成人三级做爰电影| 手机成人av网站| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 男女国产视频网站| 欧美日韩av久久| 丝袜喷水一区| 捣出白浆h1v1| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 咕卡用的链子| 午夜福利乱码中文字幕| 香蕉国产在线看| 丰满少妇做爰视频| 精品人妻在线不人妻| 久久性视频一级片| 在线观看免费高清a一片| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 在线观看人妻少妇| av超薄肉色丝袜交足视频| 黄色a级毛片大全视频| 999久久久国产精品视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| √禁漫天堂资源中文www| 老汉色∧v一级毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | av电影中文网址| 精品人妻在线不人妻| av福利片在线| 老司机影院成人| 日韩三级视频一区二区三区| 大码成人一级视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 视频区图区小说| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 午夜两性在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 制服人妻中文乱码| 91字幕亚洲| 五月开心婷婷网| 婷婷丁香在线五月| 婷婷色av中文字幕| 国产免费福利视频在线观看| 免费av中文字幕在线| 男人舔女人的私密视频| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 电影成人av| 精品国产国语对白av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲熟女毛片儿| 精品国产乱码久久久久久男人| 制服人妻中文乱码| 97在线人人人人妻| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲av男天堂| 动漫黄色视频在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 9色porny在线观看| 国产在线观看jvid| 成人黄色视频免费在线看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 大码成人一级视频| 亚洲全国av大片| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲av成人一区二区三| 国产真人三级小视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| a级毛片黄视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产精品一区二区在线不卡| 精品人妻1区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡| 日本黄色日本黄色录像| 大片电影免费在线观看免费| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99久久综合免费| 国产伦理片在线播放av一区| 免费不卡黄色视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美大码av| 午夜影院在线不卡| 免费在线观看黄色视频的| 曰老女人黄片| 国产欧美亚洲国产| 欧美少妇被猛烈插入视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产三级黄色录像| 欧美大码av| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲人成电影免费在线| 一级黄色大片毛片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲第一av免费看| 三级毛片av免费| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日本a在线网址| 亚洲av片天天在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产男女内射视频| 99久久人妻综合| 亚洲熟女精品中文字幕| 一级a爱视频在线免费观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品| 91麻豆av在线| 精品亚洲成a人片在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产三级黄色录像| 精品第一国产精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 制服诱惑二区| 一级a爱视频在线免费观看| 免费观看av网站的网址| 在线观看免费高清a一片| 亚洲视频免费观看视频| 高清av免费在线| 一个人免费看片子| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品国产区一区二| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一个人免费在线观看的高清视频 | 老司机影院成人| 最近中文字幕2019免费版| 一级毛片女人18水好多| 久久中文看片网| 欧美精品av麻豆av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美日韩一级在线毛片| 婷婷色av中文字幕| a在线观看视频网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 丝袜美足系列| 国产精品.久久久| av在线播放精品| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品一区二区在线不卡| 久久亚洲精品不卡| 成人三级做爰电影| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美成狂野欧美在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 18在线观看网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久99一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 天堂中文最新版在线下载| 黑人操中国人逼视频| 最近中文字幕2019免费版| 在线观看舔阴道视频| 天天添夜夜摸| 黑人操中国人逼视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 美女中出高潮动态图| 中文字幕色久视频| 一个人免费看片子| 亚洲免费av在线视频| 91成人精品电影| 女警被强在线播放| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 香蕉国产在线看| 蜜桃国产av成人99| 亚洲人成电影观看| 国产精品一二三区在线看| 国产黄色免费在线视频| av不卡在线播放| 在线看a的网站| 国产精品1区2区在线观看. | 国产麻豆69| 国产深夜福利视频在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 人人妻,人人澡人人爽秒播| e午夜精品久久久久久久| videos熟女内射| 大码成人一级视频| av天堂在线播放| 桃花免费在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年|