高純度阿扎霉素 B的分離純化工藝研究

朱秀良，王海燕，李 寧，林 毅，張雪霞，李曉露

(微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，河北 石家莊 050015)

阿扎霉素B是一種從鏈霉菌(Streptomycesmelanosporus)培養(yǎng)液中分離出的具有對稱性的十六元環(huán)大環(huán)雙內(nèi)酯抗生素, 分子式C54H88O18，相對分子質(zhì)量1025，為白色針狀或雪花狀結(jié)晶，在空氣中較易失去溶劑而呈無定形粉末。在純?nèi)軇┲腥芙舛刃?，溶于甲醇、氯仿、乙醇、乙酸乙酯，微溶于丙酮，不溶于苯、醚、水，易溶于混合溶劑。阿扎霉素B的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 阿扎霉素B的結(jié)構(gòu)式

阿扎霉素B具有大環(huán)內(nèi)酯抗生素抗菌的典型特征，對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、白喉棒狀桿菌、破傷風芽孢桿菌均有抑制作用[1]；具有良好的治療線蟲感染等作用，是抗寄生蟲藥研究熱點之一；能有效提高瘤胃中丙酸產(chǎn)量，是一種有發(fā)展前景的牛類生長促進劑[2]；具有免疫抑制作用，可能成為強免疫抑制劑[3]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于阿扎霉素B分離純化的報道較少,且已有的制備方法存在工藝復雜、溶媒消耗量大、所得產(chǎn)品純度不高、收率低等缺點[3～5]。作者采用大孔樹脂對阿扎霉素B粗粉進行分離純化，對樹脂類型、洗脫條件和上樣量進行了優(yōu)化。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

阿扎霉素B發(fā)酵液，華北制藥集團新藥公司；阿扎霉素B標準品(純度≥98.5%)，自制；大孔樹脂HZ816、HZ801，上海華震科技有限公司；大孔樹脂AB-8、D312，安徽三星樹脂科技有限公司；大孔樹脂XAD1600，羅門哈斯公司；乙腈，色譜純，美國Merck公司；乙醇，工業(yè)級，滄州興隆化工有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；超純水，自制。

高效液相色譜儀(996檢測器，515泵)，Waters公司；Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph公司；TGL-16G高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動相：乙腈-水(55∶45，體積比)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進樣量：10μL。

阿扎霉素B保留時間為11.3 min，以阿扎霉素B標準品為參照。

1.3 阿扎霉素B粗粉的制備

阿扎霉素B發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾，水頂洗，得菌絲體；然后加入4 BV工業(yè)乙醇攪拌浸泡2 h，真空抽濾，得阿扎霉素B浸提液；浸提液減壓濃縮除去乙醇，以乙酸乙酯為萃取溶劑，萃取3次，合并萃取液；加入萃取液體積1%的活性炭脫色，石棉板過濾，濾液減壓濃縮、結(jié)晶、干燥，得阿扎霉素B粗粉。所得粗粉產(chǎn)品純度為80%左右，粗提收率大于90%。

1.4 阿扎霉素B粗粉的分離純化

1.4.1 樹脂的預處理及再生

先用乙醇充分浸泡樹脂，除去致孔劑、色素和雜質(zhì)，用水反復洗滌至洗滌液加乙醇后無白色渾濁；然后用2 mol·L-1的鹽酸溶液攪拌浸泡4 h，水洗至中性；再用2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液攪拌浸泡4 h，水洗至中性，備用。再生方法與預處理基本相同。

1.4.2 層析樹脂的選擇

分別用預處理好的HZ816、HZ801、D312、AB-8和XAD1600樹脂100 mL裝柱，將1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于層析柱，依次用20%(體積分數(shù)，下同)、70%的乙醇洗脫，洗脫速度為2.0 mL·min-1，分管收集洗脫液，HPLC檢測，將阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液合并，計算層析收率。

1.4.3 洗脫液濃度的選擇

將1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于100 mL HZ816層析柱，先用20%的乙醇洗下極性大的雜質(zhì)，再分別用60%、70%、80%的乙醇進行洗脫，洗脫速度為2.0 mL·min-1，分管收集洗脫液，HPLC檢測，將阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液合并，計算層析收率。

1.4.4 洗脫速度的選擇

將1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于100 mL HZ816層析柱，先用20%的乙醇洗下極性大的雜質(zhì)，再用70%的乙醇洗脫，洗脫速度(mL·min-1)分別為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0，分管收集洗脫液，HPLC檢測，將阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液合并，計算層析收率。

1.4.5 上樣量的選擇

分別將0.5 g、0.75 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于100 mLHZ816層析柱，依次用20%、70%的乙醇洗脫，洗脫速度2.0 mL·min-1，分管收集洗脫液，HPLC檢測，將阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液合并，計算層析收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 層析樹脂的選擇

考察了5種大孔樹脂對阿扎霉素B粗粉的層析分離效果，結(jié)果見表1。

表1 不同型號樹脂的層析收率

由表1可知，HZ816和XAD1600兩種樹脂對阿扎霉素B的層析效果較好，層析收率較高，但XAD1600樹脂為進口樹脂，價格昂貴。因此，選定HZ816樹脂為阿扎霉素B粗粉的層析樹脂。

2.2 乙醇體積分數(shù)的選擇(表2)

表2 乙醇體積分數(shù)對層析收率的影響

由表2可知，當用體積分數(shù)為60%的乙醇洗脫時，洗脫液體積大，洗脫不集中；而用體積分數(shù)為80%的乙醇洗脫時，洗脫雖集中，但雜質(zhì)也同時被洗下，層析收率有所下降。綜合洗脫效果和層析收率，選擇乙醇的體積分數(shù)為70%。

2.3 洗脫速度的選擇(圖2)

圖2 洗脫速度對層析收率的影響

由圖2可知，洗脫速度過慢，洗脫不集中，層析收率偏低；而洗脫速度過快，有效組分與雜質(zhì)組分得不到有效分離，層析收率也不高；洗脫速度為2.0 mL·min-1時，阿扎霉素B的層析收率最高。因此，選擇洗脫速度為2.0 mL·min-1。

2.4 上樣量的選擇(表3)

表3 上樣量對層析收率的影響

由表3可知，上樣量過低，樣品分散較嚴重，層析收率偏低；隨著上樣量的增加，層析收率有所上升；但上樣量過多，會導致層析柱過載，造成阿扎霉素B與雜質(zhì)的重疊，層析收率反而下降；當上樣量為1.0 g即0.01 g·(mL樹脂)-1時，HZ816樹脂的層析收率最高。因此，選擇上樣量為0.01 g·(mL樹脂)-1。

2.5 驗證實驗

取預處理好的HZ816樹脂500 mL裝柱，將5.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于HZ816層析柱，依次用20%、70%的乙醇洗脫，洗脫速度為1 BV·h-1樹脂床體積,分管收集洗脫液，HPLC檢測，合并阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液，減壓濃縮、萃取、結(jié)晶、干燥，得阿扎霉素B精粉，結(jié)果見表4。

由表4可知，各批次所得產(chǎn)品純度均大于95%，層析收率大于72%，過程總收率大于60%。

表4 不同批次阿扎霉素B分離純化結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

研究了大孔樹脂層析分離阿扎霉素B的工藝過程，對樹脂類型、洗脫條件和上樣量進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，HZ816樹脂為最佳層析介質(zhì)，上樣量為0.01 g·(mL樹脂)-1，洗脫劑為體積分數(shù)70%的乙醇，洗脫速度為1 BV·h-1樹脂床體積。按此工藝所得產(chǎn)品純度大于95%，過程總收率大于60%。該方法簡單易行、成本低、收率高，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] 嚴淑玲，黃為一.阿扎霉素B(Azalomycin B)研究進展[J].微生物學通報，2002,29(5)：103-107.

[2] Chao-Miay L,Westley J.Elaiophylin as a rumen fermentation efficiency enhancer[J].Antibiotics,1993,46(2):350-352.

[3] Lee S Y,Kim H S,Kim Y H,et al.Production of elaiophylin by the strain MCY-846 in a submerged culture[J].J Microbiol Biotechnol,1997,7(4)：272-281.

[4] Alvi Ka,Peterson J,Hofmann B.Rapid identification of elaiophylin and geldanamycin inStreptomycesfermentation broths using CPC coupled with a photodiode array detector and LC-MS methodologies[J].J Ind Microbiol,1995,12(2)：80-84.

[5] 江曙，黃為一.阿扎霉素B提取純化工藝的優(yōu)化[J].生物技術(shù)，2008，18(4)：74-76.