銀苦黃白口服液的不同配伍對(duì)苦參堿和氧化苦參堿影響

李立順， 錢(qián)晶晶， 時(shí)維靜

(安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽(yáng)233100)

銀苦黃白口服液為臨床經(jīng)驗(yàn)方研制，由金銀花、苦參、黃芪、白茅根按6∶7∶7∶10組成。具有清熱祛濕，利水的功效，臨床用于腎炎、腎盂腎炎、尿毒癥等療效顯著。方中苦參系豆科植物苦參Sophora flavescens Air.的干燥根［1］，具有清熱燥濕，利水的功效，其主要活性成分是苦參堿、氧化苦參堿［2］。銀苦黃白口服液采用的是水提醇沉制備工藝，為考察共煎對(duì)方中化學(xué)成分的影響，本試驗(yàn)采用L8(27)正交設(shè)計(jì)，考察不同配伍對(duì)苦參堿、氧化苦參堿含有量的影響，以探討該方的配伍化學(xué)變化規(guī)律，為制備工藝的改進(jìn)提供研究數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CAMAG LINOMAT5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀;CAMAG TLC Scanner 3薄層色譜掃描儀;winCATS軟件，瑞士卡瑪;CP225D準(zhǔn)微量天平，德國(guó)賽多利斯;RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng);LG10-24A離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)。

1.2 試藥 黃芪 Astragalus membranaceua(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao.產(chǎn)地內(nèi)蒙古;白茅根 Imperata cylindrical Beauv.Var.major C.E.Hubb.產(chǎn)地安徽;金銀花Lonicera japonica Thunb.產(chǎn)地河南;苦參Sophora flavescens Ait.產(chǎn)地安徽。均購(gòu)自安徽京皖中藥飲片廠(chǎng)，藥品生產(chǎn)許可證號(hào):皖Y20020003批號(hào)20100319。經(jīng)時(shí)維靜教授鑒定為正品。

苦參堿 (110805-200306)、氧化苦參堿 (0780-200004)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;硅膠薄層板G，20 cm×10 cm，購(gòu)自青島海洋化工廠(chǎng)，批號(hào)20070724;試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 L8(27)配伍的正交設(shè)計(jì) 選黃芪、金銀花、白茅根作為3個(gè)因素，選用藥和不用藥為2個(gè)水平，同時(shí)考慮兩兩交互作用，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平

2.2 供試溶液制備 按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)配比稱(chēng)取各味藥材，加8倍量水浸30 min，煎提2次，每次1 h，合并濾液，靜置12 h，取上清液。濃縮至每1 mL相當(dāng)于1.5 g藥材，加乙醇使含醇量達(dá)75%，靜置，上清液回收乙醇，精濾，調(diào)整溶液量，使苦參含量均達(dá)35%，如法制備缺苦參樣品 (見(jiàn)表2)。精密吸取各樣品1 mL，過(guò)短中性氧化鋁柱(100～200目2 g，內(nèi)徑1 cm)，以50%甲醇洗脫約10 mL，洗脫液水浴蒸干后用甲醇溶解并定容至2 mL，冷藏備用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取苦參堿、氧化苦參堿適量，分別置10 mL量瓶中，甲醇溶解至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的溶液。

表2 苦參不同配伍的用藥比例

2.4 薄層色譜條件 硅膠G板，板厚約0.3 mm;反復(fù)試驗(yàn)后，選定三氯甲烷-甲醇-濃氨試液 (10∶1.2∶0.2)為展開(kāi)劑，置雙槽展開(kāi)缸，飽和20 min。取缺苦參、苦參藥材、全方及苦參堿、氧化苦參堿溶液，半自動(dòng)點(diǎn)樣儀噴霧條帶點(diǎn)樣各2 μL，帶寬6 mm，各2重復(fù)。置雙槽展開(kāi)缸的另側(cè)預(yù)平衡15 min，上行展開(kāi)8 cm，取出吹干，噴改良碘化鉍鉀試液 (碘化鉍鉀試液1 mL，加0.6 moL/L鹽酸溶液2 mL，加水10 mL)顯色劑，至顯色清晰。室溫15℃，相對(duì)濕度40%。此條件下，苦參堿、氧化苦參堿顯橘黃色斑點(diǎn)，分離較好，可同板比較，缺苦參樣品無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 苦參及全方薄層圖譜

2.5 薄層掃描條件 使用薄層掃描儀，全光譜掃描，苦參堿、氧化苦參堿顯色后，最佳檢測(cè)波長(zhǎng)λ=530 nm;采用吸收檢測(cè) (光源為鎢燈)，單波長(zhǎng)反射直線(xiàn)掃描法，狹縫3.0 mm×0.45 mm，掃描速度20 mm/s。

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品各1、2、3、4、5 μL，各重復(fù)2次，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按2.4項(xiàng)展開(kāi)、顯色，并按2.5項(xiàng)測(cè)定峰面積積分值，以對(duì)照品量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。二者的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍分別為:苦參堿的回歸方程為 Y=56.801+1.409X，r=0.99867，苦參堿點(diǎn)樣量在0.20～1.00 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系;氧化苦參堿的回歸方程為Y=2374.410+13.580X，r=0.99996，氧化苦參堿點(diǎn)樣量在0.20～1.00 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.7 穩(wěn)定性考查 對(duì)一薄層板的同一斑點(diǎn)每間隔2h掃描測(cè)定1次，結(jié)果顯示斑點(diǎn)在10 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.7%(n=5)。

2.8 精密度考查

2.8.1 同板精密度 精密吸取苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品溶液2 μL，于同一硅膠G薄層板上連續(xù)點(diǎn)5次，按2.4項(xiàng)展開(kāi)、顯色，并按2.5項(xiàng)測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果苦參堿RSD為1.27%(n=5);氧化苦參堿RSD為0.51%(n=5)。

2.8.2 異板精密度 精密吸取苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于5塊硅膠G薄層板上，按2.4項(xiàng)展開(kāi)、顯色，并按2.5項(xiàng)測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果苦參堿RSD為2.19%(n=5);氧化苦參堿RSD為1.88%(n=5)。

結(jié)果表明該方法的同板精密度、異板精密度均較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含有量樣品9份，分別精密加入適量苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品，按供試品溶液制備法制備，按上述薄層色譜條件及薄層掃描條件測(cè)定供試品溶液中苦參堿、氧化苦參堿的含有量。結(jié)果苦參堿平均加樣回收率為98.67%，RSD為3.67%(n=9);氧化苦參堿的平均加樣回收率為99.55%，RSD為1.94%(n=9)。2.10 配伍對(duì)苦參堿和氧化苦參堿含有量的影響 精密吸取表2中1－8號(hào)供試品溶液各2 μL，苦參堿1 μL、5 μL，氧化苦參堿1 μL、6 μL進(jìn)樣，各重復(fù)2次。按2.4項(xiàng)同板點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色，并按2.5項(xiàng)測(cè)定峰面積積分值。采用線(xiàn)性回歸二點(diǎn)法計(jì)算含有量。測(cè)定不同配伍樣品苦參堿和氧化苦參堿的含有量見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4、表5。

表3 L8(27)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 苦參堿方差分析

表5 氧化苦參堿方差分析

從表3、4、5可以看出，苦參單味藥中苦參堿含有量最低，氧化苦參堿含有量最高。5號(hào)組 (金銀花、白茅根、苦參)苦參堿含有量最高。方差分析表明，黃芪與金銀花的交互作用對(duì)苦參堿含有量的影響具有顯著性差異 (P＜0.05)，即黃芪與金銀花共用或均不用苦參堿含有量較低;黃芪對(duì)氧化苦參堿含有量的影響具有顯著性差異 (P＜0.05)，白茅根對(duì)氧化苦參堿含有量的影響具有極顯著性差異 (P＜0.01);但當(dāng)白茅根與黃芪共同配伍苦參使用，明顯降低了氧化苦參堿的含有量。

3 討論

銀苦黃白湯是臨床治療腎炎、腎盂腎炎、尿毒癥的有效方。中藥復(fù)方用藥是中醫(yī)臨床治病的特色與靈魂［3］。方劑的藥效并不是單味藥效的簡(jiǎn)單加和，而是遵循“君臣佐使”原則。強(qiáng)調(diào)方證關(guān)聯(lián)、病癥結(jié)合，使各味藥形成“有制之師”，針對(duì)相應(yīng)的證或病，達(dá)到“整體綜合調(diào)節(jié)”的效果［4］。中藥復(fù)方治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)是其中的化學(xué)物質(zhì)。在改劑型的過(guò)程中，只有明確其化學(xué)成分及其理化性質(zhì)，明確中藥有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，才有可能明確其制備過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化，才有可能實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性和臨床療效的確切性，才能保證中藥復(fù)方制劑等生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制和檢測(cè)［5］。

本項(xiàng)試驗(yàn)研究了銀苦黃白口服液不同配伍對(duì)苦參堿和氧化苦參堿含有量的影響。與配伍共煎相比苦參單味藥中苦參堿含有量最低，氧化苦參堿含有量最高，表明共煎不僅是增加了苦參堿的提取率，也有氧化苦參堿轉(zhuǎn)化為苦參堿可能［6］。3、4、5、6號(hào)共煎液中苦參堿和氧化苦參堿的總量高于單味苦參提取液的總量，其中5號(hào) (苦參+銀花+白茅根) ＞4號(hào) (苦參+黃芪) ＞6號(hào) (苦參+銀花)＞3號(hào) (苦參+黃芪+白茅根)，提示苦參與銀花、白茅根共煎能顯著增加苦參堿和氧化苦參堿的提取率;黃芪與金銀花共用或均不用組苦參堿含有量較低，提示黃芪與金銀花增加苦參堿提取率的途徑不同，共用時(shí)反而互相抑制，影響了苦參堿的提取;白茅根與黃芪共同配伍苦參使用，明顯降低了氧化苦參堿的含有量。從對(duì)苦參堿和氧化苦參堿含有量的影響角度，可以考慮黃芪不宜共煎。但對(duì)其他有效成分的影響及臨床療效的影響，還將進(jìn)一步研究，另文報(bào)導(dǎo)。

試驗(yàn)對(duì)比了多種展開(kāi)劑，如苯-丙酮-醋酸乙酯-濃氨(2∶3 ∶4 ∶0.2)［7］，甲苯-丙酮-甲醇 (8 ∶3 ∶0.5)，甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水 (2 ∶4 ∶2 ∶1)［1，8］，環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮-濃試液 (4 ∶6 ∶8 ∶0.5)［9］，三氯甲烷-甲醇-水 (7 ∶2 ∶1)和三氯甲烷-甲醇 (5 ∶0.2)［10］，三氯甲烷-甲醇-濃氨試液 (5∶0.6∶0.3)等。因苦參堿和氧化苦參堿Rf值相差較大，有的對(duì)苦參堿展開(kāi)效果較好，有的對(duì)氧化苦參堿展開(kāi)效果較好，經(jīng)調(diào)整選定三氯甲烷-甲醇-濃氨試液 (10∶1.2∶0.2)為展開(kāi)劑，可同板檢測(cè)兩項(xiàng)指標(biāo)。噴改良碘化鉍鉀試液為顯色劑，顯色穩(wěn)定。因CAMAG薄層色譜掃描儀具有自動(dòng)扣除背景的作用，故選用單波長(zhǎng)反射直線(xiàn)掃描，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確。

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