RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定痛經(jīng)寧膠囊中4種有效成分

黃文君， 龍鳳榮， 伍 慶， 乙 引， 洪 江

(1.貴州師范大學(xué)，貴州貴陽(yáng)550001;2.貴州弘康藥業(yè)有限公司，貴州貴陽(yáng)550001;3.貴州科學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550001)

痛經(jīng)寧膠囊由白芍、丹參、當(dāng)歸等九味藥材組成，具有活血化瘀，行氣散寒，調(diào)經(jīng)止痛等功效，用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)前、行經(jīng)期腹痛等［1-2］。目前，對(duì)痛經(jīng)寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少，主要是針對(duì)芍藥苷的定量測(cè)定［3］，該方成分復(fù)雜多樣，單指標(biāo)難以有效反應(yīng)制劑質(zhì)量。丹參活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，養(yǎng)血安神，為方中臣藥，其水溶性活性成分丹參素理氣止痛，原兒茶醛可抑制血小板凝聚，丹酚酸B活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)［4-6］，均為該制劑有效成分。為了更好的控制痛經(jīng)寧膠囊的質(zhì)量，故本實(shí)驗(yàn)選擇丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和芍藥苷為檢測(cè)對(duì)象，經(jīng)過對(duì)色譜條件的摸索與優(yōu)化，建立了RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定痛經(jīng)寧膠囊中丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷、丹酚酸B 4種有效成分。該法簡(jiǎn)單快速、穩(wěn)定可靠，為更好的控制該制劑質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent色譜工作站 (安捷倫科技有限公司);CH—250超聲波清洗儀 (北京創(chuàng)新德超聲電子研究所);XS205DU電子分析天平 (梅特勒-托利多)。

1.2 試藥 丹參素鈉對(duì)照品 (批號(hào):110855-200507)、原兒茶醛對(duì)照品 (批號(hào):110810-200506)、芍藥苷對(duì)照品 (批號(hào):110736-200629)、丹酚酸B對(duì)照品 (批號(hào):111562-200803)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。痛經(jīng)寧膠囊為市售(批號(hào):20110301，20110401，20110801，貴州弘康藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水 (自制)，其余試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈 (2∶1)(A)-0.05%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脫 (0 min，7%A;15 min，22%A;30 min，31%A;50 min，53%A)，體積流量1 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取原兒茶醛對(duì)照品6.52 mg置10 mL量瓶中，加稀乙醇 (529→1000，下同)稀釋至刻度，制成0.652 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密稱取對(duì)照品丹參素鈉8.78 mg、芍藥苷10.41 mg、丹酚酸B 5.72 mg，精密吸取上述原兒茶醛對(duì)照品溶液0.5 mL置于同一25 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，制成丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為0.3512 mg/mL、0.01304 mg/mL、0.4164 mg/mL 和0.2288 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。精密吸取上述對(duì)照品貯備液1 mL于5 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷、丹酚酸 B質(zhì)量濃度分別為 70.24 μg/mL、2.608 μg/mL、83.28 μg/mL 和 45.76μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，供定量測(cè)定用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取痛經(jīng)寧膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 參照制劑的工藝過程，按處方比例分別配置不含白芍和丹參的陰性樣品，照2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液分別注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷、丹酚酸B的理論塔板數(shù)均不低于10000，與相鄰成分達(dá)到基線分離，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。對(duì)照品、樣品與陰性樣品的色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 分別精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置于5 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積值(Y)對(duì)進(jìn)樣量 (X，μg)進(jìn)行線性回歸，得丹參素鈉回歸方程為 Y =953.53X －2.6216(r=0.9999);原兒茶醛回歸方程為 Y=5022.6X+1.8974(r=0.9996);芍藥苷回歸方程為Y=1285.2X+2.9049(r=0.9998);丹酚酸B回歸方程為Y=1995.1X+12.878(r=0.9999)。結(jié)果表明，丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B分別在 0.14048 ～1.4048 μg，0.00522 ～0.0522 μg，0.16656 ～1.6656 μg 和 0.09152 ～0.9152 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 對(duì)照品 (A)、樣品 (B)、丹參陰性樣品 (C)和白芍陰性樣品 (D)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)， sample(B)，negative sample without Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma(C)and negative sample without Paeoniae Radix alba(D)

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，按峰面積計(jì)算RSD值，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B的RSD分別為0.82%、1.43%、0.96%和1.61%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.45%、1.26%、0.98%和1.83%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào) (20110801)痛經(jīng)寧膠囊內(nèi)容物粉末，照2.2.2項(xiàng)下方法操作，平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B含有量的RSD分別為1.12%、2.03%、0.76%、1.58%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的痛經(jīng)寧膠囊 (批號(hào):20110801)9份，每份約0.15 g，置25 mL量瓶中，分別精密加入上述混合對(duì)照品貯備液1.6、2.0、2.4 mL，各平行3份，加稀乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，用稀乙醇加至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品測(cè)定 取3批樣品，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各自質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)掃描，丹參素鈉分別在207、221、282 nm處有吸收峰，原兒茶醛分別在207、231、280、312 nm處有吸收峰，芍藥苷分別在202、230、275 nm處有吸收峰，丹酚酸B分別在206、224、254、286、308 nm處有吸收峰。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，本實(shí)驗(yàn)比較了230 nm與280 nm波長(zhǎng)下樣品的吸收，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用230 nm同時(shí)測(cè)定4種成分時(shí)的響應(yīng)值和峰形優(yōu)于采用280 nm測(cè)定結(jié)果。

3.2 提取條件的選擇 由于丹酚酸B的熱不穩(wěn)定性［9］，故選擇超聲提取。丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B均為水溶性成分，本實(shí)驗(yàn)考察了純水，稀乙醇，95%乙醇，50%甲醇及80%甲醇的提取效果，結(jié)果表明，稀乙醇與50%甲醇優(yōu)于其他溶劑，二者對(duì)丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷的提取率相當(dāng)，而稀乙醇對(duì)丹酚酸B的提取率高于50%甲醇;進(jìn)一步試驗(yàn)，以稀乙醇為提取溶劑，分別超聲提取20、30、45 min，發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min各組分均可提取完全。故本實(shí)驗(yàn)選擇稀乙醇作提取溶劑超聲提取30 min制備供試品溶液。

3.3 流動(dòng)相的選擇 由于丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B均為酸性化合物，為改善其拖尾現(xiàn)象，故在流動(dòng)相中加入酸來(lái)改善峰形，而醋酸在230 nm有吸收，容易發(fā)生基線的漂移，因此選擇加入磷酸，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料［10-13］，也比較了甲醇與乙腈的分離效果，選擇了甲醇-乙腈(2∶1)(A)－0.05%磷酸 (B)系統(tǒng)，經(jīng)梯度洗脫優(yōu)化，最終確定了上述最佳流動(dòng)相。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Content determination of samples(n=3)

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