HPLC同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地滇重樓中的6種重樓皂苷

李 懿， 何 佳， 趙庭周， 楊永紅， 蘇 豹， 馬 青， 韋建榮*

(1.云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明650032;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南昆明650201)

滇重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.的干燥根莖，極具藥用價(jià)值，主要分布在我國(guó)滇、川地區(qū)，具有清熱解毒、消腫止痛、平喘止咳、涼肝定驚之功效，多用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蟲蛇咬傷、跌打傷痛等癥［1-2］。現(xiàn)代化學(xué)研究，已從重樓屬植物中分離鑒定出50余種化合物，其中主要成分為甾體皂苷類，約占總化合物數(shù)目的80%，并含有甾醇、甾醇苷、黃酮苷、C21孕甾烷型苷等。甾體皂苷是其主要活性成分，其苷元主要為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元［4-8］。本研究中重樓皂苷Ⅵ，Ⅶ，PA，H 屬于偏諾皂苷，重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ?qū)儆谑硎氃碥眨?-3］，目前文獻(xiàn)對(duì)重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ研究較多，對(duì)重樓皂苷PA，H的研究相對(duì)較少?，F(xiàn)代藥理研究表明，重樓屬藥材具有抗腫瘤、抗菌消炎、止血、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抑制精子活性、抗細(xì)胞毒、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理活性［9］。

由于滇重樓繁殖率低，其傳統(tǒng)藥用部位根莖的自然生長(zhǎng)速度十分緩慢，從種子生長(zhǎng)為藥用商品，一般需10～15年，野生重樓資源再生較慢。近年來隨著藥用范圍不斷擴(kuò)大，對(duì)商品藥材需求量逐年增加，現(xiàn)有藥源遠(yuǎn)不能保障市場(chǎng)需要，僅靠野生資源已不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)，加之主產(chǎn)區(qū)亂采濫挖，忽視對(duì)滇重樓資源的保護(hù)和繁育，野生種質(zhì)資源遭到嚴(yán)重破壞，逐年的大量采挖已使野生滇重樓資源日趨枯竭，從而誘發(fā)滇重樓價(jià)格不斷攀升，在此情況下，摸清目前滇重樓資源情況具有重要意義;通過走訪滇重樓的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，實(shí)地采集標(biāo)本，收集樣品，對(duì)不同產(chǎn)地的滇重樓資源進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，全面掌握目前滇重樓資源狀況，為有效保護(hù)和合理利用滇重樓資源收集資料并提供科學(xué)依據(jù)。

1 藥材與試劑

1.1 藥材來源 分析樣品產(chǎn)自云南省境內(nèi)13個(gè)州(市、地區(qū))，涉及約75個(gè)采集點(diǎn)，采集重樓屬植物植株292株，所有標(biāo)本具有標(biāo)簽及原植株生境照片，同時(shí)記錄來源、生境、氣候、地形、土壤、植被、海拔等相關(guān)信息，資料現(xiàn)收藏于云南白藥研究院;共獲得分析樣品69份，樣品經(jīng)云南白藥集團(tuán)股份有限公司趙庭周工程師、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊永紅教授鑒定，其中56份為重樓屬藥用植物滇重樓Paris polyphylla var.yunnanensis。

1.2 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100)，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器。乙腈為色譜純，水為三蒸水。重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào) 111590-200402，111591-200402，111592-200402，111593-200402);重樓皂苷PA，H對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品處理 新鮮植株采集后除去泥沙等雜質(zhì)，取根莖，減壓下40℃烘干，粉碎，細(xì)粉分包密閉后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 定量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，0～10 min，5% ～20%A，10～50 min，20% ～42%A，50～90 min，42% ～80%A，90～100 min，80%～95%A，洗脫時(shí)間為100 min;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 線性關(guān)系 分別取在40℃下減壓干燥的重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ，PA，H對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇制成0.4 mg/mL的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣4、8、12、14、16、20 μL，得到回歸方程為:AⅠ=561.18 CⅠ+16.2，r=0.9998;AⅡ=539.73CⅡ+14.4，r=0.9994;AⅥ=645.0.7CⅥ+13.2，r=0.9992;AⅦ=462.4CⅦ+19.8，r=0.9995;APA=603.16CPA+20.1，r=0.9997;AH=617.69CH+14.6，r=0.9993。

2.2.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率試驗(yàn) 6種重樓皂苷的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD范圍分別為 0.97% ～ 1.32%，1.34% ～ 1.69%，1.17% ～1.52%，表明精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好;重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ，PA，H 加樣回收率分別為:98.73%，98.17%，98.86%，98.01%，98.92%，98.33%，加樣回收率的 RSD范圍分別為 1.01% ～1.37%，0.74% ～ 1.21%，1.07% ～ 1.44%，1.15% ～1.68%，0.94% ～1.56%，1.33% ～1.82%。

2.2.4 樣品測(cè)定 對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備按2010年版《中國(guó)藥典》一部重樓藥材項(xiàng)下含量測(cè)定的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，色譜圖見圖1;每份樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取均值，各樣品重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ，PA，H測(cè)定的 RSD范圍分別為 1.43% ～1.88%，1.52% ～1.95%，1.23% ～1.92%，1.51%～2.16%，1.62% ～ 1.91%，1.68% ～2.07%，測(cè)定結(jié)果見表1。

圖1 6種重樓皂苷對(duì)照品及香格里拉維西縣永春鄉(xiāng)四保1號(hào)樣色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of six Paris polyphylla var.yunnanensis.for standard and sample

3 討論

3.1 按照樣品產(chǎn)地和樣本量情況，以地理區(qū)域進(jìn)行歸類合并，對(duì)偏諾皂苷量(重樓皂苷Ⅵ，Ⅶ，PA及H之和)、薯蕷皂苷量(重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ之和)以及6種皂苷量之和進(jìn)行比較。綜合來看，滇東南地區(qū)(紅河州)、滇西北地區(qū)(香格里拉、怒江、麗江)的樣品偏諾類皂苷量較高，滇西地區(qū)(大理州)樣品的薯蕷皂苷量較高，6種皂苷量之和較高地區(qū)為大理、紅河、滇西北、滇西地區(qū)及滇中地區(qū)(楚雄州)的部分區(qū)域，而滇南地區(qū)(西雙版納)重樓樣品的3個(gè)指標(biāo)較其他地區(qū)略低，這可能與這些地區(qū)特殊的氣候、自然地理?xiàng)l件導(dǎo)致植株生長(zhǎng)速度較快有關(guān)。

3.2 從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出，測(cè)定的56個(gè)樣品中，測(cè)出重樓皂苷Ⅰ的50個(gè)，占樣品總數(shù)89.29%，測(cè)出重樓皂苷Ⅱ的51個(gè)，占樣品總數(shù)91.07%，測(cè)出重樓皂苷Ⅵ的3個(gè)，占樣品總數(shù)5.36%，測(cè)出重樓皂苷Ⅶ的54個(gè)，占樣品總數(shù)96.43%，測(cè)出重樓皂苷H的52個(gè)，占樣品總數(shù)92.86%，測(cè)出重樓皂苷PA的31個(gè)，占樣品總數(shù)55.36%;結(jié)果表明，各地所產(chǎn)滇重樓，重樓皂苷含有量差異很大，同時(shí)，從數(shù)據(jù)也可看出，各地所產(chǎn)滇重樓的6種重樓皂苷之間質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動(dòng)并無顯著性規(guī)律，呈現(xiàn)為隨機(jī)波動(dòng)，但同一區(qū)域(地域)所產(chǎn)重樓，其各類皂苷量有一定的可比性及相似的變化規(guī)律，說明皂苷量與產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境等因素關(guān)系密切，鄒亮等［10］曾對(duì)不同產(chǎn)地滇重樓不同部位的4種重樓皂苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布狀況進(jìn)行

研究，結(jié)果表明滇重樓的品質(zhì)表現(xiàn)出一定的地域和生境依賴性，且各部位重樓皂苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)也存在明顯差異，因此實(shí)施中藥材GAP管理，重視和發(fā)展地道藥材，規(guī)范地道藥材的種植，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和必要性;同時(shí)加強(qiáng)生物量?jī)?yōu)勢(shì)品種與皂苷量?jī)?yōu)勢(shì)品種的雜交育種研究，培育新的、經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高的栽培種，是有效保護(hù)和合理利用滇重樓資源的可行途徑。

表1 不同產(chǎn)地滇重樓中重樓皂苷測(cè)定(n=3)Tab.1 Determination of polyphyllin from different origins of Paris polyphylla var.yunnanensis.(n=3)

致謝:資源調(diào)查和樣品采集工作得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所大力協(xié)助，在此表示衷心的感謝。

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