補骨脂生品及炮制品體外抑菌活性研究

李昌勤， 趙 琳， 康文藝

(河南大學(xué)中藥研究所，河南開封475004)

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實。其性溫，味辛、微苦，歸腎、脾經(jīng)［1］。內(nèi)服多以炮制品入藥，其炮制原理和方法始載于南北朝的《雷公炮炙論》，記載的炮制方法主要有清炒、酒浸炒、鹽炙(制)、鹽蒸、雷公法等不同方法［2］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對補骨脂的研究表明補骨脂具有抗菌、抗病毒、增強免疫力、抗腫瘤、治療骨質(zhì)疏松、平喘、肝藥酶誘導(dǎo)、治療白癜風(fēng)及對藥物代謝等作用［3］。

其中，補骨脂揮發(fā)油對革蘭氏陽性菌有抑制作用［4］。補骨脂中的異補骨脂查耳酮、補骨脂二氫黃酮甲醚和erythrinin A有較強的抗金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌作用，其黃酮苷3，5，3'，4'-四羥基-7-甲氧基黃酮-3'-O-α-L-吡喃木糖(1→3)-O-α-L-吡喃阿拉伯糖(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖苷對金黃色葡萄球菌、菌銅綠假單胞菌及真菌尖孢鐮刀菌和指狀青霉有抑制作用［5-6］。補骨脂酚在體外有抑制金黃色葡萄球菌生長的作用，萜酚類成分psoracorylifols A～E具有抗幽門螺旋桿菌的活性［7-8］。余建清等對補骨脂不同炮制品的抗菌作用進行了比較，結(jié)果顯示，以酒浸炒品的抗菌作用最顯著［9］。

目前對補骨脂的研究比較廣泛和深入，但其不同炮制品體外抑菌活性的系統(tǒng)研究報道較少，本實驗對補骨脂生品及不同炮制品的抑菌活性進行了系統(tǒng)的研究，從抑菌圈、MIC和IC50值對其抑菌活性進行了比較。為其進一步的抑菌機理的研究和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料與儀器

1.1 藥材 補骨脂購于開封市樂仁堂總店，經(jīng)河南大學(xué)中藥研究所生藥教研室李昌勤副教授鑒定。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌(Staphlococcus aureus，SA，ATCC25923，購于上海天呈生物信息有限公司)，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)和 β-內(nèi)酰胺酶陽性金黃色葡萄球菌(ESBLs-SA)河南大學(xué)附屬淮河醫(yī)院臨床分離獲得(經(jīng)全自動微生物分析儀VITEK-AMS鑒定，99%的符合率)。小檗堿(本研究所自制，純度＞95%)。

1.3 培養(yǎng)基 Broth Medium、Nutrient Agar(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)。

1.4 儀器 ZWX-201A紫外線空氣消毒器;LRH-150生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);JJ-CJ-2FD潔凈工作臺(吳江市凈化設(shè)備總廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph);電子天平(Mettler-Toledo)。

2 實驗部分

2.1 補骨脂炮制品的制備［10-13］

2.1.1 凈補骨脂 取原藥材，揀去雜質(zhì)，清水洗凈，撈出，曬干。用時搗碎。

2.1.2 炒補骨脂 取補骨脂600 g置炒制容器內(nèi)炒至微鼓起有噼啪聲響。

2.1.3 鹽炙補骨脂 取補骨脂600 g，以鹽水(粗鹽12 g→100 mL水)拌勻，悶潤4 h，置炒制容器內(nèi)炒至微鼓起有噼啪聲響。

2.1.4 鹽蒸補骨脂 取補骨脂600 g，以鹽水(粗鹽12 g→100 mL)悶潤過夜，蒸2 h。

2.1.5 雷公法制補骨脂 取補骨脂600 g加黃酒900 mL，浸泡過夜，濾去余液，以蒸餾水900 mL浸3 d，濾去水分后蒸6 h。

2.1.6 酒炙補骨脂 取補骨脂600 g加黃酒900 mL，浸泡過夜，濾去余液，置炒制容器內(nèi)炒至微鼓起有噼啪聲響。

2.2 樣品及對照品的制備 補骨脂生品及炮制品，甲醇浸泡2次，每次3 d，合并濾液，減壓回收溶劑，得生品及炮制品的甲醇總提取物。將生品及炮制品的甲醇總提取物分別分散于80%甲醇-水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，濾液濃縮，得到相應(yīng)生品及炮制品的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位浸膏。分別稱取得到的生品及炮制品的甲醇總提取物以及石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位的浸膏，用DMSO配成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，即得各樣品溶液。對照品小檗堿用DMSO配成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 的溶液。

2.3 體外抗菌實驗方法

2.3.1 K-B實驗法 按照文獻［14］，在超凈工作臺上將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，平皿標(biāo)記后，用無菌移液管移取已配好的菌液0.1 mL加入平皿中，用涂布器將菌液涂布均勻，制成帶菌平板，將含藥紙片等距置于含菌平板，同時用DMSO做空白對照。置37℃恒溫生化箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，測定抑菌圈直徑。每份樣品均平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2.3.2 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定 將樣品用DMSO進行倍比稀釋后，按2.3.1項操作進行，平行操作3次取平均值，用DMSO作空白對照，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。出現(xiàn)抑菌圈的最低樣品質(zhì)量濃度即為此樣品的MIC值，所有操作均在無菌條件下進行。

2.3.3 半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)的測定［15-16］將90 μL在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h的金黃色葡萄球菌菌液(SA，MRSA，ESBLs-SA)分別加入潔凈無菌的96孔培養(yǎng)板中，加入不同質(zhì)量濃度梯度的樣品母液10 μL，溶劑(DMSO)終質(zhì)量濃度為1/10樣品母液質(zhì)量濃度。同時設(shè)陰性對照、空白對照和溶劑對照，每個處理3個重復(fù)。將96孔板于37℃下，培養(yǎng)20 h后，用酶標(biāo)儀測定595 nm處的光吸收值，各樣品以相同條件下的上清液吸收度值作為空白對照，減去空白對照即為含菌量的吸收度，相應(yīng)上清液是在10000/6 min的條件下制備，對應(yīng)吸取100 μL。按下面公式計算出抑制率(%):

抑制率(%)=［(溶劑對照孔OD值－相應(yīng)上清液OD值)－(藥液孔OD值－相應(yīng)上清液OD值)］/(陰性對照 OD值－相應(yīng)上清液 OD值)×100%

以樣品濃度和抑制率作圖，求出線性回歸方程，計算抑制率為50%時的質(zhì)量濃度即為IC50值。

3 結(jié)果

3.1 抑菌圈的測定和最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定 按照2.3.1和2.3.2項實驗方法進行試驗，各樣品對SA、MRSA、ESBLs-SA的的抑菌圈和 MIC值數(shù)據(jù)見表1。

3.2 各樣品對 SA、MRSA、ESBLs-SA 的 IC50值 數(shù)據(jù)見表1。

4 結(jié)論

表1抑菌圈結(jié)果顯示，補骨脂甲醇總提取物和石油醚部位的活性明顯好于乙酸乙酯部位和正丁醇部位的活性。補骨脂生品及炮制品甲醇總提取物對SA的抑菌圈由大到小:鹽炙補骨脂、炒補骨脂、鹽蒸補骨脂、雷公法炙補骨脂、酒炙補骨脂(12 mm)，補骨脂生品(11 mm);對MRSA的抑菌圈由大到小:炒補骨脂、雷公法炙補骨脂、酒炙補骨脂(12 mm)，鹽炙補骨脂、補骨脂生品(11 mm)，鹽蒸補骨脂(10 mm);對ESBLs-SA的抑菌圈由大到小:酒炙補骨脂(12 mm)，雷公法炙補骨脂(11 mm)，鹽炙補骨脂、炒補骨脂、鹽蒸補骨脂、補骨脂生品(10 mm)。補骨脂生品及炮制品的石油醚部位與甲醇總提取物對SA的抑菌圈結(jié)果相同。補骨脂生品及炮制品的石油醚部位對MRSA和ESBLs-SA的抑菌圈相同，結(jié)果由大到小為酒炙補骨脂(12 mm)，炒補骨脂、鹽蒸補骨脂(11 mm)，鹽炙補骨脂、雷公法炙補骨脂、補骨脂生品(10 mm)。

表1 各樣品對受試菌種的抑菌圈、MIC值和IC50值Tab.1 The diameter of antibacterial rings，the MIC and IC50of the samples

酒炙補骨脂(甲醇總提取物)和酒炙補骨脂(石油醚部位)在質(zhì)量濃度為50 mg/mL對3種菌的抑菌圈均為12 mm，活性最好;補骨脂生品(正丁醇部位)在質(zhì)量濃度為50 mg/mL對3種菌的抑菌圈最小均為8 mm。經(jīng)炮制后乙酸乙酯部位和正丁醇部位均較生品的抗菌活性增加，不同的炮制方法對活性增加的程度有不同的影響，對SA和MRSA的抑菌圈顯示，酒炙補骨脂的正丁醇部位較生品由8 mm增加到12 mm，活性增加最明顯，對ESBLs-SA的抑菌圈顯示，酒炙補骨脂的甲醇總提取物和石油醚部位較生品由10 mm增加到12 mm，活性增加最明顯。

表1的 MIC值顯示，補骨脂生品各部位對SA的活性由高到低:石油醚部位(31.3 μg/disc)，甲醇總提取物、乙酸乙酯部位(62.5 μg/disc)，正丁醇部位(250 μg/disc);對MRSA活性由高到低:石油醚部位(31.3 μg/disc)，甲醇總提取物(62.5 μg/disc)，乙酸乙酯部位(125 μg/disc)，正丁醇部位(250 μg/disc);對ESBLs-SA活性由高到低:石油醚部位、甲醇總提取物(31.3 μg/disc)，乙酸乙酯部位(125 μg/disc)，正丁醇部位(250 μg/disc);說明石油醚部位是補骨脂生品主要的抑菌活性部位。

由MIC值可以看出，對SA的抑制活性，炮制后的補骨脂MIC值均小于對應(yīng)生品，其中炒補骨脂(甲醇總提取物)，鹽炙、鹽蒸、雷公法炙、炒補骨脂(石油醚部位)活性最好，MIC值均為7.9 μg/disc;對MRSA，石油醚部位的活性較其它部位活性好，活性由高到低為補骨脂生品(MIC=31.3 μg/disc)，鹽炙補骨脂(MIC=15.7 μg/disc)，鹽炙、鹽蒸、雷公法炙、炒補骨脂(MIC=7.9 μg/disc);對 ESBLs-SA，甲醇總提取物中雷公法制補骨脂的MIC最大，為62.5 μg/disc，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各部位中雷公法制補骨脂的MIC也最大(MIC=31.3 μg/disc，125 μg/disc，250 μg/disc)，即對于菌種 ESBLs-SA，雷公法炮制的補骨脂抑菌活性較其它炮制方法炮制的補骨脂活性低。

對SA的抑制活性酒炙補骨脂(石油醚部位)最好，IC50是0.10 mg/mL，雷公法制補骨脂(正丁醇部位)最低，IC50是 4.24 mg/mL;對 MRSA 的抑制活性，補骨脂生品(甲醇總提取物)最好，IC50是0.16 mg/mL;鹽炙補骨脂(石油醚部位)最低，IC50是4.64 mg/mL;對ESBLs-SA的抑制活性，鹽蒸補骨脂(甲醇總提取物)活性最好，IC50是0.28 mg/mL，鹽炙補骨脂(石油醚部位)最低，IC50是4.38 mg/mL。IC50值顯示酒炙補骨脂活性較好，其中酒炙補骨脂甲醇總提取物對SA、MRSA、ESBLs-SA的抑制活性均較好，IC50分別是 0.76、0.69、0.89 mg/mL，均小于 1.00 mg/mL。

綜上所述，補骨脂生品和炮制后的補骨脂對SA、MRSA、ESBLs-SA的抑制作用明顯，尤其是酒炙補骨脂抑菌活性增強的較顯著。補骨脂的藥用價值顯示出良好的開發(fā)前景，本實驗首次采用補骨脂生品及炮制品的甲醇總提取物及石油醚、乙酸乙酯和正丁醇不同部位的浸膏作為樣品進行研究，結(jié)果明確了其主要抗菌活性部位，使后續(xù)的研究更加有針對性，并為其進一步的抑菌機理的研究提供了科學(xué)依據(jù)，對臨床上治療各種致病菌感染有重要意義。

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