GC/MS法和 UPLC/Q-TOF-MS法研究丹香冠心注射液中的有效成分

王少敏， 胡 青， 季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)

丹香冠心注射液是一種常用的中藥注射液，具有活血化瘀，理氣開竅的功能，臨床用于冠心病、心絞痛、心肌梗死屬瘀血閉阻證等。其不良反應(yīng)主要為過敏反應(yīng)，如靜滴時引起頭痛、藥疹、藥物熱、皮膚瘙癢等，少量嚴(yán)重不良反應(yīng)為靜脈炎和過敏性休克、呼吸困難、喉水腫。為明確丹香冠心注射液的組成成分以進一步控制質(zhì)量安全，對其進行物質(zhì)基礎(chǔ)研究成為必要。

中藥注射液是一個復(fù)雜系統(tǒng)，物質(zhì)成分眾多，類別多樣，性質(zhì)差異大，大量成分含量低。傳統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究方式多采用色譜吸附分離技術(shù)得到純度高的單體化合物后，再獲取光譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進行結(jié)構(gòu)鑒定。該方法需要大量的人力物力，耗時長，分離鑒定含量低的成分難度大。近年來，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速，如氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC－MS)可用于實現(xiàn)揮發(fā)油成分快速分離定性，而液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則是研究中藥中非揮發(fā)性成分的重要手段，其中超高效液相-四級桿/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS)技術(shù)具備分析速度快、高靈敏度、準(zhǔn)確質(zhì)量和全譜記錄等特點，可以提供準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)、碎片信息和可能結(jié)構(gòu)，對于未知化合物的鑒定是強有力的工具［1］。

丹香冠心注射液處方由丹參、降香兩味藥組成，主要工藝為丹參水提醇沉酸堿除雜，降香水蒸氣蒸餾揮發(fā)油，二者合并。根據(jù)工藝推測，最終產(chǎn)品中應(yīng)含有丹參水溶性成分和降香的揮發(fā)性成分。本實驗分別采用GC/MS和UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)，對其物質(zhì)基礎(chǔ)進行了研究。

1 儀器與試藥

美國安捷倫公司Agilent 6890N GC/5973N MSD氣相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀;MSD Chemistation D 03.00.611數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);美國Waters Acquity@ 超高效液相譜儀色譜儀;美國 Micromass Synapt Q-TOF-MS(四級桿－飛行時間質(zhì)譜儀);Epppendorf 5810R臺式離心機。甲醇、乙腈為色譜純，由Fluca公司提供，石油醚、乙酸乙酯為農(nóng)殘級純，由Merck公司提供，

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):反式 －苦橙油醇對照品(批號:0001421969，Sigma公司);降香揮發(fā)油對照品(批號:111579-200201);丹參素鈉(批號:110855-200203);原兒茶醛(批號:110810-200205);丹酚酸 B(批號:111562-200302);原兒茶酸(批號:809-200102)均購自中國藥品生物制品檢定所。

丹香冠心注射液:批號:0909025、091003、0911083、0912048、0912065、1001036、1002019、1002060、1003035、1003054(生產(chǎn)企業(yè) A:上海中西制藥有限公司);批號:090508、090510、090720、090812、090917、091101、091107、091222、100304、100306(生產(chǎn)企業(yè)B:上海新亞藥業(yè)高郵有限公司)。

2 溶液的制備

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 GC－MS對照品溶液 取降香揮發(fā)油和反式－苦橙油醇對照品適量，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液。

2.1.2 UPLC-Q/TOF-MS對照品溶液的制備 取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、原兒茶酸等對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 GC－MS供試品溶液 取丹香冠心注射液10 mL，置具塞試管加入2 mL石油醚，渦旋2 min，靜置，待分層后，取上清液，備用，下層溶液中加入2 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，靜置，待分層后，取上清液，石油醚液與乙酸乙酯溶液作為不同極性部位供試品溶液進行分析。同時不取樣品溶液，按上述方法，制備相應(yīng)隨行空白溶液。

2.2.2 UPLC-Q/TOF-MS供試品溶液 取丹香冠心注射液，過0.22 μm的濾膜，取續(xù)濾液，即得。

3 色質(zhì)聯(lián)用條件

3.1 GC-MS條件 色譜柱:Agilent Innowax毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);升溫程序:初始溫度100℃，以2℃/min的速率升溫至200℃并保持5 min，載氣:氦氣，體積流量1.2 mL/min;分流比1∶1;進樣體積1 μL;進樣口溫度:280℃;氣質(zhì)接口溫度:250℃;電離方式:電子轟擊(E I);電離能量:70 eV;掃描質(zhì)量范圍:30～600 AMU;掃描間隔:0.5 s。

3.2 UPLC-Q/TOF-MS 條件 UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm ×50 mm);流動相 A 為乙腈，B為0.01%甲酸溶液，體積流量0.3 mL/min;柱溫25℃;進樣量10 μL。采用以下兩種梯度洗脫程序分別對應(yīng)Q/TOF-MS的正、負(fù)離子檢測模式:①0～30 min，5%→30%A;30 ～60 min，30%→50%A，60 ～90 min，50%→70%A，90 ～100 min，70%→95%A;100～110 min 5%A;②:0 ～5 min，5%A;5 ～90 min，5%→22%A，90 ～95 min，22%→95%A，95 ～100 min，5%A。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);采用正、負(fù)離子兩種模式檢測，毛細(xì)管電壓為3200 V，錐孔電壓為35 V，檢測器電壓為2000 V;脫溶劑氣流為600 L/h，脫溶劑氣流為350℃，錐孔氣流量為50 L/h，離子源溫度為120℃，0.2 s采集一次譜圖;質(zhì)量校正液(Lockspay)為亮氨酸-腦啡肽(leucine－enkephalin，［M+H］+=556.2771，［M － H］－=554.2615)，質(zhì)量掃描范圍:m/z 50 ～900。

4 結(jié)果

4.1 揮發(fā)性物質(zhì) 對2個廠家的20批樣品進行檢測，結(jié)果各廠家生產(chǎn)的10批樣品圖譜基本一致，結(jié)合所有供試品溶液總離子流圖譜，扣除相應(yīng)的隨行溶劑空白中的干擾峰，共檢出25個色譜峰，見圖1。對相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%的19個峰進行質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)與Nist數(shù)據(jù)庫和對照品匹配，鑒定出反式－苦橙油醇等6個化合物，另13個化合物經(jīng)推斷均為苦橙油醇系列衍生物，其中12個化合物組成了三組同分異構(gòu)體。按各色譜峰的質(zhì)譜裂片圖與文獻(xiàn)核對［2-6］，對基峰、質(zhì)荷比和相對豐度等方面進行直觀比較，分別對各個色譜峰加以確認(rèn)，綜合各項分析鑒定，其中第一組同分異構(gòu)體:峰5，7，11，12，20(保留時間為 32.6 min，33.5 min、41.2 min、41.7 min、46.5 min)的質(zhì)譜圖與文獻(xiàn)報道的氧化苦橙油醇一致，推斷該5個色譜峰為氧化苦橙油醇5個同分異構(gòu)體。第二組同分異構(gòu)體由峰3，4，6，8，14(保留時間分別為 31.9 min、32.3 min、32.8 min、33.6 min、43.2 min)組成，對其質(zhì)譜裂片信息進行解析，推測其可能結(jié)構(gòu)為氧化苦橙油醇的一個氫原子被羥基取代。第三組同分異構(gòu)體:峰13和峰15(保留時間分別為42.7 min、44.2 min)的質(zhì)譜圖中具有與第二組相似的裂片:m/z 55.1，m/z 70.0，m/z 125.1，m/z 195.2，而峰 18(保留時間為 46.0 min)則具有與第三組相似的裂片信息:m/z 55.1，m/z 70.0，m/z 111.1，m/z 125.1，m/z 195.2，說明其均為結(jié)構(gòu)相似的苦橙油醇系列化合物，見表1和圖1～2。

圖1 對照品及丹香冠心注射液樣品GC/MS總離子流圖Fig.1 GC/MS ion chromatograms of reference substances and Danxiang Guanxin Injetion

4.2 水溶性成分 同一廠家生產(chǎn)的10批樣品圖譜基本相似，丹香冠心注射液中水溶性成分主要為來自丹參中的酚酸類物質(zhì)，在負(fù)離子模式下容易帶電荷，另外，為保證某些成分在正離子模式下響應(yīng)較好，質(zhì)譜上分別對負(fù)離子和正離子兩種模式進行采集，獲得的化合物相互進行補充，按3.2項分析條件，繪制UPLC/Q-TOF-MS BP I正、負(fù)離子掃描總離子流圖，見圖3。根據(jù)部分標(biāo)準(zhǔn)品定位和文獻(xiàn)進行鑒定［7-12］，結(jié)果負(fù)離子模式中響應(yīng)峰較多，鑒別出24個化合物，正離子模式中鑒別出6個化合物，其中5個已在負(fù)離子質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)，故共鑒定了圖譜中的25個主要色譜峰，見圖3和表2。

表1 丹香冠心注射液中揮發(fā)性成分Tab.1 The volatile compounds in Danxiang Guanxin Injection

圖2 反式－苦橙油醇對照品及系列衍生物GC/MS質(zhì)譜裂片圖Fig.2 GC/MS fracture ion chromatograms of reference substances and it’s derivatives

圖3 丹香冠心注射液的UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖(正、負(fù)離子模式)Fig.3 UPLC/Q-TOF-MS total ion chromatograms of reference substances and Danxiang Guanxin Injetion

表2 丹香冠心注射液水溶性成分Tab.2 The water-soluble compounds in Danxiang Guanxin Injection

(續(xù)表2)

5 討論

5.1 為完全提取不同極性的揮發(fā)性成分，采用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇不同溶劑依次提取丹香冠心注射液樣品，結(jié)果表明三氯甲烷、正丁醇部位總離子流圖中基本無色譜峰，說明石油醚和乙酸乙酯已基本將揮發(fā)性成分完全提取。

5.2 對非極性和極性兩種氣相色譜柱進行了考察，并配以相適應(yīng)的升溫程序，① HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);梯度升溫程序為初始80℃，保持10 min，以5℃/min升至280℃;② Agilent Innowax 毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);梯度升溫程序為初始100℃，以2℃/min升至200℃，保持5 min。結(jié)果后者對色譜峰分離度更好，選擇柱②進行分析。

5.3 對UPLC色譜條件進行了考察，采用不同填料(C18和T3硅膠)、不同長度(50 mm，100 mm，150 mm)的3根色譜柱進行了試驗，結(jié)果以C18填料、柱長50 mm的UPLC色譜柱得到的譜圖中色譜峰多且分離度好。以乙腈-0.01%甲酸溶液為流動相體系，進行梯度洗脫，乙腈由5%變化至95%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)因樣品中水溶性成分主要為酚酸類，極性較強，多出現(xiàn)在5%～40%乙腈比例，故最終確定以較低乙腈比例的流動相體系進行洗脫，使各化合物分離良好。

5.4 對目前國內(nèi)市場上的丹香冠心注射液進行了收集，發(fā)現(xiàn)目前市場上的丹香冠心注射液均由上海中西制藥有限公司和上海新亞藥業(yè)高郵有限公司兩家企業(yè)生產(chǎn)。另有獲得批準(zhǔn)文號的四家生產(chǎn)企業(yè)未進行生產(chǎn)。對上述兩個廠家產(chǎn)品各10批樣品進行物質(zhì)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，同一廠家的10批產(chǎn)品得到的圖譜非常相似;兩個廠家的水溶性部分成分和強度基本相似，而揮發(fā)性成分差別較大。上海中西制藥有限公司的丹香冠心注射液總離子流圖中色譜峰個數(shù)較多，且峰強度較大，與降香揮發(fā)油對照品圖譜相比，多出包括三組同分異構(gòu)體共十余個峰，但無反式－苦橙油醇的峰。而上海新亞藥業(yè)高郵有限公司的丹香冠心注射液總離子流圖中峰個數(shù)較少，整體與降香揮發(fā)油對照品的圖譜相似，反式－苦橙油醇色譜峰較明顯，見圖1。推測兩家產(chǎn)品的差異可能是由降香原料和生產(chǎn)工藝中參數(shù)的不同造成。

5.5 本次物質(zhì)基礎(chǔ)研究表明，丹香冠心注射液中的揮發(fā)性成分主要由苦橙油醇及其衍生物組成，水溶性成分主要由丹參中的酚酸類成分組成，與根據(jù)工藝推測的結(jié)果一致。

5.6 色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具備分析速度快、高靈敏度、準(zhǔn)確質(zhì)量和全譜記錄等特點，可以提供準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)、碎片信息和可能結(jié)構(gòu)，對于未知化合物的鑒定是強有力的工具。本實驗采用兩種色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對已有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物進行了準(zhǔn)確的定性，并通過質(zhì)譜碎片信息的研究對丹香冠心注射液中同類組分或同系組分進行大概的結(jié)構(gòu)推測，說明是色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究物質(zhì)基礎(chǔ)的有力工具，也為物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了一種思路。

［1］王艷萍，豐加淘，金 郁，等.中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的思路與方法［J］.中國天然藥物，2009，7(1):13-18.

［2］匡榮仁，王 富，李國珍，等.降香中氧化苦橙油醇結(jié)構(gòu)研究［J］.中草藥，2004，35(7):736-737.

［3］Zhao Qian，Guo Jixian，Zhan Yunyi，et al.Chemical and pharmacological research in Chinese drug“Jiangxiang”［J］.中國藥學(xué)雜志，2000，9(1):1-3.

［4］劉洪玲.GC-MS法分析降香揮發(fā)油化學(xué)成分［J］.中成藥，2009，31(6):915-917.

［5］郭麗冰，王 蕾，廖華衛(wèi)，等.降香CO2超臨界萃取物的GCMS 分析［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2007，23(1):12-13.

［6］宋曉濤，趙 穎，張文生，等.降香藥材及其制劑指紋圖譜研究［J］.天津中醫(yī)藥，2003，20(1):51-54.

［7］郭增軍，龍麗輝，徐 穎，等.UPLC-ESI-MS分析丹參藥材、脂溶性及水溶性提取物的色譜、質(zhì)譜行為及相關(guān)性［J］.中藥材，2010，33(6):925-929.

［8］趙新鋒，王中秋，趙 欣，等.丹參的 HPLC-ESI-MSn分析［J］.中成藥，2005，27(9):1068-1069.

［9］魏英杰，李 萍，舒 斌，等.高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法鑒定復(fù)方丹參方化學(xué)及代謝成分［J］.分析化學(xué)雜志，2007，35(1):13-18.

［10］匡榮仁，王 富，馮學(xué)偉，等.香丹注射液的指紋圖譜研究［J］.中草藥，2005，36(7):1007-1019.

［11］陳 勇，張 玲，王世敏.丹參水溶性成分的電噴霧質(zhì)譜行為及其特征圖譜的初步研究［J］.分析化學(xué)，2004，32(11):1421-1425.

［12］王紅蕾，齊 巍，吳小東，等.丹參水溶性多酚酸的多級串聯(lián)電噴霧離子阱質(zhì)譜斷裂機理解析［J］.質(zhì)譜學(xué)報，2008，29(3):129-136.