瘦素及I和Ⅲ型膠原蛋白在肝纖維化大鼠肝組織中的變化

朱 凈，潘 亮，許 晶，陸靜嫻，黃 華，陸翠華

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇南通 226001)

瘦素(Leptin)是一種由肥胖基因編碼的分泌型蛋白質(zhì)，其與肝病的關(guān)系受到關(guān)注［1］。本實驗研究了大鼠肝纖維化發(fā)生發(fā)展中Leptin及Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的變化。

1 材料方法

1.1 試劑:RT-PCR兩步法試劑盒 (上海捷瑞)，引物(上海生工)。兔抗大鼠Leptin與Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體 (武漢博士德)。

1.2 動物處理:清潔級60只雄性SD大鼠(150±20 g，南通大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:2022650)，分為對照組［皮下注射橄欖油溶液(3 mL/kg)］和模型組［給予60%CCl4(V/V)(精制橄欖油配置)3 mL/kg，每周2次，共6周］。每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥物用量。第6周模型組大鼠死亡2只。于2、4和6周末分批取對照及模型組肝臟，部分置－80℃冰箱，待作Western blot及RT-PCR檢測;另一部分10%甲醛固定，用于病理學(xué)觀察。

1.3 Leptin與Ⅰ、Ⅲ 型膠原檢測:Western blot:肝組織勻漿，裂解后蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，分別加入Leptin與Ⅰ、Ⅲ 型膠原和β-actin一抗過夜，加二抗孵育1 h后，膠片顯影。RT-PCR:引物各一對，Leptin:5'-TGGTCC TATCTGTCCTATGTT-3'，5'-GGAGGTTCTCGCAGGTTCT-3';Ⅰ型膠原:5'-GGCAAGACAGTCATCGAATACA-3'，5'-GATTGGG ATGGAGGGAGTTTA-3';Ⅲ型膠原:5'-CCACCCTGAACTCAA GAGC-3'，5'-TGAACTGAAAGCCACCATT-3';內(nèi)參照 GAPDH:5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，5'-TCCACGACATACTCAGC AC-3'，產(chǎn)物大小分別為 286、147、212 及191 bp。Trizol法提總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA后行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)電泳，觀察條帶。將Western blot及PCR條帶掃入電腦，以“凝膠分析軟件”讀取吸光度值(IA值)，Ⅰ、Ⅲ 型膠原與Leptin IA值/β-actin(GAPDH)IA值表示Ⅰ、Ⅲ 型膠原與Leptin蛋白及mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下結(jié)果:CCl4注射第2周時肝小葉小片肝細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤，輕度纖維組織增生。CCl4注射第4周時肝小葉大片肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞呈明顯的脂肪變性，膠原纖維由匯管區(qū)深入小葉內(nèi)，但沒包裹。CCl4注射第6周時肝細(xì)胞變性壞死更加嚴(yán)重，有大量纖維間隔形成。

2.2 Leptin與Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白及mRNA的表達(dá):模型組2、4、6周Leptin與Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白及mRNA表達(dá)均逐漸增強(qiáng)(P＜0.05)。在肝纖維化過程中，3者的動態(tài)表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)(圖1，2，表1)。

圖1 Western blot檢測Leptin與Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白的表達(dá)Fig 1 The protein expression of leptin，collagenⅠ and collagenⅢassayed by western blot

表1 Leptin與Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及mRNA在各組中半定量結(jié)果Table 1 The semi-quantitation results of leptin，collagenⅠ and collagenⅢ protein and mRNA

圖2 Leptin與Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)檢測結(jié)果Fig 2 The gene expression of leptin，collagenⅠ and collagenⅢassayed by RT-PCR

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠Leptin僅在少量竇周細(xì)胞表達(dá)，CCl4注射2周后，Leptin在纖維間隔中的成纖維細(xì)胞、肝竇周細(xì)胞等肝臟間質(zhì)細(xì)胞開始表達(dá)，并隨著CCl4注射時間的延長，肝纖維化程度的加重。模型各組大鼠肝組織中Leptin蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，至6周時達(dá)到最高峰，且Leptin表達(dá)與Ⅰ、Ⅲ型膠原呈動態(tài)正相關(guān)。有研究表明，Leptin可上調(diào)肝纖維化Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)，推測增高的Leptin水平可能通過促進(jìn)TGFβ1的表達(dá)，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞質(zhì)活化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展［2］。因此，Leptin作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子推測其致肝纖維化機(jī)制可能與促進(jìn)HSC的增殖和活化有關(guān)，Leptin可能成為今后藥物治療及預(yù)防肝病新的切入點。

［1］Handy JA，F(xiàn)u PP，Kumar P，et al.Adiponectin inhibits leptin signalling via multiple mechanisms to exert protective effects against hepatic fibrosis［J］.Biochem J，2011，15，440:385－395.

［2］Liu Y，Brymora J，Zhang H，et al.Leptin and acetaldehyde synergistically promotes α-SMA expression in hepatic stellate cells by an Interleukin 6-dependent mechanism［J］.Alcohol Clin Exp Res，2011，35:921 －928.