低氧對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生存的影響及與細(xì)胞自噬的關(guān)系

劉雅婷，楊愛軍，楊 麗，李雙明，向 琳，劉燕菲，李 敏，2*

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究所，甘肅蘭州730000;2.甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000;3.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院病理科，甘肅蘭州 730000)

腫瘤在宿主中生長，需要宿主提供更多的O2，腫瘤生長的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于支持它的物質(zhì)［1］。在此過程中雖然有擬態(tài)血管的形成，但腫瘤血管的結(jié)構(gòu)及功能都存在異常，因此氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)都相對缺乏，在實(shí)體瘤中經(jīng)常會出現(xiàn)低氧的現(xiàn)象。然而腫瘤細(xì)胞卻可以在這種微環(huán)境中繼續(xù)生存，特別是一群具有干細(xì)胞特性的CD133+細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)。

自噬的發(fā)生會形成雙層膜的自噬體，之后與溶酶體結(jié)合，分解胞質(zhì)中的大分子及細(xì)胞器［2］。起初認(rèn)為自噬同凋亡及細(xì)胞壞死一樣作為細(xì)胞的死亡形式，之后有研究表明自噬為一種新的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，尤其是在低氧及缺血的微環(huán)境中。自噬會因細(xì)胞系的不同及腫瘤生長的不同階段發(fā)揮不同的作用。本實(shí)驗(yàn)擬研究低氧微環(huán)境對結(jié)腸癌細(xì)胞生存的影響并觀察其與自噬之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480由本實(shí)驗(yàn)室提供，常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每2天換液傳代。將細(xì)胞置于氧氣含量控制在1%，94%N2及5%的CO2。

1.2 免疫磁珠分選

取10瓶對數(shù)生長期結(jié)腸癌SW480細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)為107個)，胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入300 μL的緩沖液緩沖(0.5%BSA 2 mmol/L EDTA 0.01%PBS)重懸，再加入FCR阻斷劑及CD133磁性微珠(Miltenyi公司)各100 μL，充分混勻，置于4 ℃ 暗處避光孵育30 min。加入10～20倍細(xì)胞體積的緩沖液洗滌，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入500 μL的緩沖液緩沖重懸。將MS分選柱安裝在磁性分選架上，加0.5 mL緩沖液后潤洗分選柱將細(xì)胞移入MS分選柱中，并加入4倍體積的緩沖液，細(xì)胞懸液流出(此時為CD133－細(xì)胞)。當(dāng)液體停止流出時，將分選柱移出分選架，用配套的塞子快速的將剩余液體壓入瓶中，此時得到CD133+細(xì)胞。

1.3 CD133+細(xì)胞體外培養(yǎng)

將分選后的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含2%B27、20 μg/L bFGF、20 μg/L EGF 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，每3天加液1次，分別于分選后0、7和14 d倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

1.4 錐蟲藍(lán)染色

稱取4 g錐蟲藍(lán)，少量去離子蒸餾水研磨，加雙蒸水至100 mL，用濾紙過濾，4℃保存。使用時，用PBS稀釋至0.4%。胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋。細(xì)胞懸液與0.4%錐蟲藍(lán)溶液以9∶1混合混勻(終濃度0.04%)。在3 min內(nèi)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染，呈無色透明狀。活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.5 Boyden小室實(shí)驗(yàn)

在Boyden小室的下室中加入200 μL的完全培養(yǎng)液，兩室之間放一張孔徑為8 μm的多聚碳酸酯膜，膜上均勻鋪濃度為3 000 g/L的膠原50 μL，將小室放入37℃、5%CO2聚合30 min。細(xì)胞用胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，每個上室內(nèi)加入濃度為1×105個細(xì)胞懸液200 μL，置于對照組正常O2和實(shí)驗(yàn)組1%O2的微環(huán)境中孵育24及48 h，實(shí)驗(yàn)終止后常規(guī)HE染色，在200倍光鏡下每張膜計(jì)數(shù)5個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)平均數(shù)。各組重復(fù)3次。

1.6 電鏡觀察

用胰蛋白酶消化收集對照組正常O2和實(shí)驗(yàn)組1%O2的 SW480細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，PBS沖洗3次，每次5 min，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇系列脫水，氧化丙稀浸潤，環(huán)氧樹脂包埋并制成切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。

1.7 MDC熒光檢測自噬囊泡

用胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基反復(fù)吹打并收集細(xì)胞，加入50 μmol/L MDC 37 ℃、5%CO2孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，95% 乙醇固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，加入5 μmol/L PI 室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min，通風(fēng)處晾干后，使用倒置熒光顯微鏡(NiKon)觀察并攝片。

1.8 自噬的流式細(xì)胞術(shù)定量分析

以MDC染色法后，細(xì)胞用95%乙醇固定，流式細(xì)胞儀以488 nm激發(fā)波長，測定MDC染色的熒光強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間差異比較采用方差分析，所有指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 低氧微環(huán)境(1%O2)對結(jié)腸癌細(xì)胞生存的影響

2.1.1 CD133+細(xì)胞體外培養(yǎng):免疫磁珠分選法得到CD133+細(xì)胞，大小均一，圓形，散在分布，懸浮不貼壁。無血清培養(yǎng)48 h后可見部分細(xì)胞成團(tuán)生長，72 h后可形成較小的細(xì)胞球，7 d后細(xì)胞球逐漸生長，體積變大，14 d時細(xì)胞球數(shù)量增多且體積增大，半貼壁生長(圖1)。

2.1.2 低氧微環(huán)境對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響:SW480細(xì)胞在1%O2微環(huán)境中24及48 h的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于常氧(P＜0.05);另外在不同時間相同微環(huán)境中48 h穿膜的細(xì)胞數(shù)顯著高于24 h(P＜0.05)(表1)。

2.1.3 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞活細(xì)胞率的影響:與對照組相比，低氧微環(huán)境中SW480細(xì)胞的活細(xì)胞率隨著時間的延長而降低(P＜0.05);但對CD133+細(xì)胞的活細(xì)胞率無顯著改變(表2)。

圖1 CD133+細(xì)胞體外生長情況Fig 1 Growth and proliferation of CD133+CSCs

表1 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響Table 1 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+invasion at 24 and 48 hours(±s，%，n=3)

表1 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響Table 1 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+invasion at 24 and 48 hours(±s，%，n=3)

*P＜0.05 compared with SW480(21%O2)24 hours;#P＜0.05 compared with SW480(21%O2)48 hours.

48 hours SW480 71.00±6.56 134.33±10.50 91.33±6.81* 270.33±10.51 group 21%O224 hours 21%O248 hours 1%O224 hours 1%O2#9.27 CD133+ 43.67±11.24 59.67±4.51 52.00±13.75 56.67±2

表2 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞活細(xì)胞率的影響Table 2 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+viability at 24 and 48 hours(x ±s，%，n=3)

2.2 低氧微環(huán)境(1%O2)對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的影響

2.2.1 低氧微環(huán)境中SW480細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化:與對照組相比，1%O248 h可見到自噬體的形成。即胞質(zhì)中出現(xiàn)大量獨(dú)立雙層膜結(jié)構(gòu)，且逐漸延伸、彎曲。包含部分胞質(zhì)成分以及溶酶體等細(xì)胞器形成大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體(圖2)。

2.2.2 低氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細(xì)胞自噬水平的變化:MDC是一種特異性自噬標(biāo)志物，自噬囊泡形成后，MDC可被細(xì)胞吸收進(jìn)入囊泡，熒光顯微鏡下可觀察到胞核周發(fā)出藍(lán)綠色點(diǎn)狀熒光。1%O248 h后，CD133+細(xì)胞及SW480細(xì)胞均可見到MDC陽性細(xì)胞 (圖3)。

2.2.3 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響:MDC可以在細(xì)胞發(fā)生自噬時出現(xiàn)在自噬囊泡中，與常氧微環(huán)境中相比，細(xì)胞在1%O2微環(huán)境中SW480細(xì)胞的熒光強(qiáng)度有所降低，而CD133+細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增加(P＜0.05);但兩類細(xì)胞均不具有時間依賴性(表3)。

3 討論

表3 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬水平的影響Table 3 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+autophagy at 24 and 48 hours(x ±s，%，n=3)

在正常的人體微環(huán)境中，動脈血的含氧量為10%～15%，而正常組織中的氧分壓較低為3%～6%，在這種氧分壓下對正常組織和細(xì)胞并沒有細(xì)胞毒作用［1］。低氧在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用十分復(fù)雜，氧氣的不足給腫瘤細(xì)胞帶來多重效應(yīng)。一方面，腫瘤細(xì)胞和其他細(xì)胞一樣需要運(yùn)用氧氣產(chǎn)生能量以及作為發(fā)揮生物效應(yīng)的基礎(chǔ)，這其中包括合成生物大分子，因此低氧的微環(huán)境會限制腫瘤細(xì)胞的增長，但同時也會選擇小部分更加惡性的細(xì)胞適應(yīng)此環(huán)境而發(fā)生抵抗，這其中就包括CD133+細(xì)胞。CD133+細(xì)胞為存在于腫瘤組織中具有干細(xì)胞特性的一小群細(xì)胞，與腫瘤的形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥相關(guān)，具有自我更新和分化潛能［3］。對于結(jié)直腸癌的常規(guī)放療及化療可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但實(shí)際上僅有部分患者對治療有反應(yīng)，干細(xì)胞理論認(rèn)為這種情況與腫瘤內(nèi)部存在少部分CD133+細(xì)胞相關(guān)［4］。低氧不但可以維持CD133+細(xì)胞的表型、促進(jìn)CD133+細(xì)胞自我更新，還可以抑制其向成熟的腫瘤細(xì)胞分化［5］;另一方面，腫瘤細(xì)胞會有到多余氧氣去的傾向性，氧氣會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［6］。

近期有研究顯示，在低氧的微環(huán)境中會使自噬的發(fā)生增加從而發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)作用，使腫瘤細(xì)胞存活［7－8］;也有研究認(rèn)為自噬的發(fā)生與凋亡的作用一致誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。自噬作用的差異可能與腫瘤生長的不同時期或者相同時期不同的細(xì)胞系相關(guān)［9－10］。有研究表明，在腫瘤發(fā)生的早期，抑制自噬可以導(dǎo)致前癌細(xì)胞的持續(xù)生長，說明在此階段自噬具有抑制腫瘤的作用;但當(dāng)腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂，快速生長缺乏氧氣及營養(yǎng)供給時，自噬的誘發(fā)可降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器從而為腫瘤細(xì)胞的生長提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，說明此階段自噬發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活的作用［11］。同樣，在同一時期不同的細(xì)胞系也會因自噬的發(fā)生表現(xiàn)出存活或者抑制現(xiàn)象。因此本研究以低氧及自噬為靶點(diǎn)，探討兩類相關(guān)細(xì)胞在其中可能存在的不同生存表現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，低氧的微環(huán)境使SW480細(xì)胞的數(shù)量隨時間的延長而減少，CD133+細(xì)胞數(shù)量基本保持不變，說明低氧使大部分細(xì)胞死亡，但同時保護(hù)了CD133+細(xì)胞中的一部分耐低氧微環(huán)境、抵抗力強(qiáng)的細(xì)胞，這一小部分細(xì)胞符合干細(xì)胞特性。在低氧的微環(huán)境中觀察細(xì)胞的侵襲性，大量SW480細(xì)胞進(jìn)入下室，說明此種微環(huán)境雖然使部分細(xì)胞死亡但殘存細(xì)胞的侵襲力卻是增加的。雖然有文獻(xiàn)顯示干細(xì)胞的侵襲性要強(qiáng)于普通細(xì)胞，但在本實(shí)驗(yàn)中，低氧狀態(tài)對CD133+細(xì)胞的侵襲性無影響。

運(yùn)用電鏡觀察到自噬體的形成，免疫熒光，流式細(xì)胞儀觀察到低氧微環(huán)境中SW480細(xì)胞隨時間的延長自噬水平下降，而CD133+細(xì)胞自噬的水平增加，可能是由于SW480細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的供給而死亡，在此過程中自噬并沒有被激活;在相同的低氧微環(huán)境中誘發(fā)CD133+細(xì)胞發(fā)生自噬，并發(fā)揮了保護(hù)作用，因此CD133+細(xì)胞會有一部分繼續(xù)分化，使腫瘤繼續(xù)生長。這其中可能正是由于CD133+細(xì)胞的存在對腫瘤的繼續(xù)生長發(fā)揮了重要作用。

在實(shí)驗(yàn)中低氧誘導(dǎo)SW480細(xì)胞死亡，CD133+細(xì)胞存活，這兩種相反的作用都可能與自噬相關(guān)，相同的低氧微環(huán)境誘導(dǎo)兩類細(xì)胞自噬發(fā)生的趨勢并不相同。同時，SW480細(xì)胞會逃離低氧區(qū)域，向富含氧氣的組織轉(zhuǎn)移，因此在一定區(qū)域抗血管治療可能會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向另一組織尤其是血管中的侵襲轉(zhuǎn)移;那么，是低氧改變自噬的發(fā)生還是自噬隨細(xì)胞類型的不同而發(fā)生改變，需要進(jìn)一步研究。

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