外源性磷酸肌酸鈉對缺血再灌注骨骼肌保護機制的實驗研究

丁 明，李大鵬，王昕輝，劉明明

斷肢再植、四肢大血管損傷、骨筋膜室綜合征、血栓形成及應(yīng)用止血帶時間過長等，均會引起肢體缺血。 缺血-再灌注（ischemia-refusion，I-R）損傷的概念也早已被提出[1]。目前認為缺血再灌注損傷與能量代謝有重要關(guān)系[2]。外源性磷酸肌酸鈉作為一種外源性的能量合劑，臨床上已經(jīng)用于心臟停搏液中的心肌保護、充血性心衰及未成熟心肌保護等方面[3-5]。但外源性磷酸肌酸鈉對骨骼肌缺血再灌注損傷的影響尚未見報道。本實驗制備家兔肢體缺血再灌注損傷模型，探討外源性磷酸肌酸鈉對肢體缺血再灌注骨骼肌的作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型建立 健康成年家兔40只，體重2.5～3.5 kg，雌雄不限，由中國人民解放軍第八十九醫(yī)院動物中心提供。隨機分為對照組、缺血再灌注組（IR）、低濃度磷酸肌酸鈉組（LCP)和高濃度磷酸肌酸鈉組（HCP），每組10只。

1.2 實驗方法 參照Crinnion等方法建立家兔后肢缺血再灌注損傷動物模型[6]。3%戊巴比妥鈉（25 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉。無菌手術(shù)顯露左大腿股血管鞘并游離股動靜脈，于腹股溝韌帶處用微血管夾阻斷股動靜脈，在阻斷處以下用橡皮帶彈性環(huán)扎以阻斷側(cè)支循環(huán)。4 h后取下橡皮帶及血管夾，恢復(fù)肢體血供。①對照組：只解剖出股動靜脈，不阻斷不環(huán)扎；②缺血組：缺血4 h，恢復(fù)血流灌注前耳緣靜脈給予生理鹽水1 ml，恢復(fù)血流再灌注4 h；③低濃度組：缺血4 h，恢復(fù)血流灌注前耳緣靜脈給予外源性磷酸肌酸鈉溶液 （北京利祥制藥有限公司生產(chǎn)，0.5 mg/ml，生產(chǎn)批號 100602）0.5 g，再灌注 4 h；④高濃度組：缺血4 h，恢復(fù)血流灌注前耳緣靜脈給予外源性磷酸肌酸鈉1 g，再灌注4 h。

1.3 檢測項目及方法 四組分別于缺血前、缺血再通后1 h、缺血再通后4 h，3個時相點自右側(cè)頸內(nèi)靜脈采集血樣，并取術(shù)側(cè)脛前肌組織，行免疫組織化學(xué)并制備電鏡標(biāo)本。

1.3.1 生化指標(biāo)檢測 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）的測定采用羅氏P800全自動生化分析儀。丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）測定采用硫代巴比妥鈉法和黃嘌呤氧化酶法，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照說明書操作。主要儀器有Spectrumlab 22PC（上海棱光技術(shù)有限公司）分光光度計。

1.3.2 Bax、Bcl-2蛋白免疫組化檢測和圖像分析采用Image-pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)軟件對脛前肌組織切片進行分析，相同亮度低倍鏡（×100）下拍攝圖片，每張切片隨機選擇5個視野，得出統(tǒng)計場積分光密度值（IOD）。

1.3.3 電鏡觀察 將取得的脛前肌標(biāo)本切成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，經(jīng)30 g/L戊二醛4℃前固定2 h，再經(jīng)鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。應(yīng)用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，多組樣本均數(shù)之間比較進行方差齊性檢驗，組間兩兩比較進行單因素方差分析，方差齊采用LSD法，不齊則采用Dunnet’s T3法。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果 缺血組再灌注后1、4 h，IR組較對照組 AST、LDH、MDA 顯著升高 （P<0.01），SOD的活力則顯著下降（P<0.01）；HCP和LCP組較IR 組 AST、LDH、MDA 降低顯著 （P<0.05），SOD 的活力則顯著升高（P<0.01），且HCP組較LCP組變化明顯（P<0.05）。 見表 1。

表 1 四組AST、LDH、SOD、MDA變量關(guān)系（n=10）

2.2 Bc1-2蛋白、Bax蛋白表達及Bc1-2/Bax比值變化 缺血再灌注1、4 h后，IR組Bcl-2/BAX比值較對照組顯著降低（P<0.01）。見表2。

表 2 四組Bcl-2、BAX基因Bcl-2/BAX變量關(guān)系（n=10）

2.3 電鏡檢測結(jié)果 三組缺血前均顯示正常橫紋肌肌組織結(jié)構(gòu)。見圖1～3。

圖 1 缺血再灌注后4 h IR組電鏡圖片

圖 2 缺血再灌注后4 h LCP組電鏡圖片

圖 3 缺血再灌注后4 h HCP組的電鏡圖片

3 討 論

肢體缺血再灌注損傷指肢體缺血達到一定時間，在恢復(fù)血供后，反而出現(xiàn)比缺血時更加嚴(yán)重的損傷，表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)與功能損害的進一步加重。臨床常見的缺血再灌注損傷有嚴(yán)重組織水腫、骨筋膜室綜合征、肌纖維攣縮，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肢體殘疾。肢體缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚未完全明了，目前觀點較多，如氧自由基損傷、鈣超載、白細胞浸潤和內(nèi)皮的自穩(wěn)態(tài)失衡等。其中氧自由基在肢體缺血再灌注損傷中的作用得到多數(shù)人肯定，是造成缺血再灌注損傷發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[7，8]。

正常肌細胞內(nèi)含豐富的AST、LDH，肌細胞受損后，酶可釋放入血。因此，血清中該酶的含量可作為肌細胞損傷的指標(biāo)，含量高低可反映細胞損傷的程度。測定SOD的活力可反映組織內(nèi)自由基水平及脂質(zhì)過氧化的程度[9]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，它的含量反映了機體脂質(zhì)過氧化的速度和強度，間接反映體內(nèi)自由基的水平，其含量可間接反映肢體缺血再灌注損傷的程度。

Bcl-2基因具有促進細胞生存的作用，通過抑制鈣離子釋放[10]、抑制p53誘導(dǎo)細胞凋亡[11]、抑制自由基生成[12]、穩(wěn)定線粒體膜[13]發(fā)揮作用。Bax基因與Bcl-2作用相反，屬于促凋亡基因。最新研究表明，Bax蛋白發(fā)揮作用需要通過與Bcl-2蛋白形成二聚體。Bax高表達，形成Bax/Bax同源二聚體促進凋亡；Bcl-2高表達，則形成Bcl-2/Bax異源二聚體抑制凋亡。Bcl-2與Bax的比值是決定細胞凋亡作用強弱的關(guān)鍵[14]。

缺血再灌注損傷與線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變有重要關(guān)系。線粒體是細胞能量代謝中心，在維持細胞生理功能中發(fā)揮重要作用，尤其在缺血再灌注損傷發(fā)生及其發(fā)展中起中心環(huán)節(jié)作用[15]。外源性磷酸肌酸鈉（CP）能維持線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整，使線粒體膜電位維持在較高水平，維持呼吸鏈正常氧化磷脂化功能，保證ATP的正常生成，維持細胞內(nèi)高能量水平。CP可以抑制5’-核苷酸酶的活性，使溶血磷脂酸甘油脂濃度下降，穩(wěn)定磷脂膜。CP維持ATP高水平，使氧自由基生產(chǎn)減少，保護機體免受氧自由基損傷。CP能使細胞較快恢復(fù)Ca2+順利反流入肌漿網(wǎng)，避免細胞內(nèi)游離鈣離子濃度偏高。

本文實驗結(jié)果顯示，缺血再灌注后IR、HCP、LCP各組 AST、LDH、MDA均升高，SOD亦有下降（P<0.05），但 IR 組 AST、LDH、MDA 升高及 SOD 下降均較LCP組顯著（P<0.05），較HCP組非常顯著（P<0.01）。Bcl-2/BAX比值在HCP與LCP組升高，對細胞凋亡起到一定抑制作用。表明再灌注期間，氧自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成骨骼肌細胞的損傷，經(jīng)電鏡形態(tài)學(xué)觀察證實在缺血再灌注4 h后細胞損傷明顯。應(yīng)用CP組細胞損傷較缺血組減輕，且高濃度組保護作用更為明顯。說明應(yīng)用外源性磷酸肌酸鈉能顯著保護缺血再灌注時肌細胞，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少MDA的生成，維持SOD的活力，保護細胞膜的完整性，抑制AST、LDH的釋放，減輕細胞內(nèi)線粒體的損傷，對肢體缺血再灌注損傷有顯著的保護作用。本研究為外源性磷酸肌酸鈉在肢體缺血再灌注損傷保護方面，提供了一定的實驗參考。

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