• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雞傳染性支氣管炎病毒分離株與疫苗株抗原相關(guān)性和S1基因序列分析

    2012-07-16 07:37:54任海松張秀美崔言順許傳田楊少華李建亮胡北俠
    關(guān)鍵詞:核苷酸血清型毒株

    任海松,張秀美,崔言順,許傳田,楊少華,李建亮,胡北俠*

    (1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東泰安 271018;2.山東農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所;3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東 濟南 250100)

    雞傳染性支氣管炎是由(Infectious bronchitious,IB)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitious-Virus,IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病。該病原是冠狀病毒科、冠狀病毒屬第三抗原群的代表種[1]。是我國規(guī)定的禽類二類傳染病之一。本病能夠在雞的呼吸道、消化道、腎臟、輸卵管、腺胃等多個部位復(fù)制,能夠?qū)е码u群生產(chǎn)效益的大幅度下降,所造成的損失往往遠遠大于直接死亡引起的損失,給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的危害[2]。

    S1基因是IBV的主要免疫原基因,S1蛋白與病毒的免疫保護性有關(guān),并且S1蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生病毒的中和抗體、血凝抑制抗體及細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[3,4]反應(yīng)等。與病毒的抗原性和血清型有重要的關(guān)系。血清中和試驗(VN)是一種區(qū)別不同血清型差別的最敏感的方法[5,6]。本實驗通過雞胚交叉中和試驗8株山東省分離株進行血清學(xué)分型,并結(jié)合S1基因序列分析,探討兩者之間的關(guān)系,旨在為臨床疫苗應(yīng)用和病毒防治提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 病毒分離與鑒定

    對疑似IBV的病料按常規(guī)方法處理后接種9-11日齡SPF雞胚,37℃培養(yǎng),觀察雞胚病變,并通過新城疫病毒干擾試驗,RT-PCR等方法對病毒進行鑒定。8個IBV分離株的背景資料及基因序列GenBank登錄號見表1。

    1.2 引物、菌種、質(zhì)粒和試劑

    S1基因引物序列參考文獻[6],由上海生物工程有限公司合成。p EASY-T1 載體,購自北京全式金公司。PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit、Trizol和Gel Ext raction Kit,均購自大連寶生物工程有限公司。DH5α菌種為本實驗室保存。

    1.3 病毒增殖及RNA的提取

    將IBV分離株分別接種9-11日齡的SPF雞胚,37℃培養(yǎng)72 h后(棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚)無菌收集尿囊液,離心后,按TRIzol試劑(Invitrogen)說明書提取病毒基因組RNA。

    1.4 IBV分離株S1基因擴增、克隆測序以及核苷酸序列的比較分析

    應(yīng)用RT-PCR 方法擴增S1基因,將回收后的PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體進行連接反應(yīng)后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)菌液PCR 初步鑒定后,委托北京六和華大基因科技股份有限公司測序。利用lasergene7.0生物軟件,將IBV分離株S1基因分別與GenBank中參考株S1基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進行同源性比較和系統(tǒng)進化分析。

    表1 山東省商業(yè)雞群中分離的8株IBV分離株的分離背景Table 1 Eight IBV strains isolated from commercial flocks in Shandong province of China

    1.5 IBV疫苗株(491和H120)和分離株陽性血清的制備

    [7]方法,用SPF雞分別制備IBV疫苗株(491,H120)和分離株的陽性血清。

    1.6 IBV雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測定

    將IBV分離株和疫苗株用0.01 M PBS緩沖液(PH7.2)進行10倍倍比稀釋,取10-4~10-85個稀釋度分別接種9~11日齡SPF雞胚5枚,0.2 mL/胚,37℃孵育至18日齡,每日照胚2次,棄去24 h內(nèi)死亡雞胚,根據(jù)雞胚死亡及病變情況,按Reed–Muench法計算EID50[8]。

    1.7 雞胚中和試驗

    參考文獻[9]方法,采用固定病毒稀釋血清的方法,陽性血清進行2倍倍比比稀釋,每個稀釋度分別與等體積200EID50的病毒液混勻,室溫作用60 min后接種9~11日齡SPF雞胚,0.2 mL/胚,每稀釋度接種5枚,置37℃培養(yǎng)至18日齡,棄去24 h內(nèi)死亡雞胚,根據(jù)雞胚死亡及病變進行結(jié)果判定,以能使50%以上雞胚保護的血清最高稀釋倍數(shù)為血清的中和效價??乖嚓P(guān)性的計算按免疫學(xué)方法進行:相關(guān)系數(shù)(R)源血清效價1/同源血清效價1,r2=異源血清效價2/同源血清效價2[10]。R>80%時為同一血清型,R在25%和80%之間為同一血清型的不同亞型,R≤25%時為不同血清型。

    2 結(jié)果

    2.1 S1基因序列測定結(jié)果以及與參考株遺傳進化分析

    8個IBV分離株S1基因序列測定結(jié)果顯示:其中6個IBV分離株S1基因ORF長度為1620個bp,分別編碼540個氨基酸(包括蛋白酶裂解位點);分離株SDTA06111S1基因ORF長度為1611個bp,編碼537個氨基酸;CK/CH/SD09/005毒株S1基因ORF長度為1640個bp,編碼546個氨基酸;8個分離株之間S1基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為65.6% ~99.6%和61.0% ~99.1%;與參考毒株核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別介于62.4% ~99.4%和51.9% ~98.7%。8個分離株與疫苗株H120和491核苷酸序列同源性分別介于:65.5% ~99.3%和78.2% ~78.5%(見表3);以疫苗株H120為參考,發(fā)現(xiàn)8個IBV分離株S1基因存在廣泛的基因突變和氨基酸替代現(xiàn)象,其中分離株CK/CK/SD09/005在98-99(G)、142-143(S)、288-289(QKEP),375-376(S)位核苷酸處共插入了7個氨基酸(圖略)。

    圖1 8個IBV分離株與參考毒株S1基因遺傳進化樹Fig.1 Phylogenetic tree generated from the nucleotide sequences of the S1 genes of published IBV strains obtained from GenBank and eight IBV isolates

    根據(jù)S1基因核苷酸序列繪制的遺傳進化樹顯示(圖1):8個IBV分離株(下劃線為分離株)和26個參考毒株形成4個進化群。其中SDTA0611與H120等在內(nèi)的21個分離株構(gòu)成了基因I群,491、UK793和J2組成基因II群;包括SDLY0612在內(nèi)的6個分離株與三個參考毒株構(gòu)成基因III群,分離株CK/CH/SD09/005和參考株TC07-2(GQ265948,中國廣東分離株)形成獨立的第IV基因群。

    2.2 雞胚交叉中和試驗

    IBV疫苗株H120、491和8個分離株雞胚交叉中和試驗結(jié)果見表2。從表2可見,疫苗株H120和491不能交叉中和,說明二者分屬不同的血清型;疫苗株陽性血清對IBV分離株的中和試驗結(jié)果表明:8個分離株中有6個分離株(分別是S1,S2,S3,S4,S7和S8)可以被H120陽性血清中和,3個分離株可以同時被H120和491陽性血清中和(分別是S3,S7和S8),2個分離株(S5和S6)不能被H120或491陽性血清中和。8個IBV分離株陽性血清對H120和491的中和試驗結(jié)果是:H120可以被5個分離株陽性血清中和(S1,S2,S3,S4和S8),491可以被除S6之外的7個分離株陽性血清中和。疫苗株和8個分離株之間交叉中和試驗結(jié)果顯示:H120和5個分離株(S1、S2、S3、S4和S8)之間具有雙向交叉中和反應(yīng),與S7僅有單向交叉中和作用;491和3個分離株(S3、S7和S8)之間具有雙向交叉中和反應(yīng),與4個分離株(S1、S2、S4和S5)之間僅有單向交叉中和反應(yīng)。

    表2 IBV分離株與疫苗株491,H120的中和價Table 2 Neutralization titers between IBV isolates and 491,H120

    2.3 分離株與疫苗株的抗原相關(guān)系數(shù)

    表3 IBV分離株和疫苗株491,H120的抗原相關(guān)系數(shù)Table 3 Antigenic relatedness values(R)and S1 gene nucleotide identity between IBV isolates and 491,H120 strains

    3 討論

    S1基因作為重要的免疫原基因,并具有高度的變異性。S1基因遺傳進化分析顯示,8個分離株中6個毒株與常用疫苗株H120、MA5和491遺傳距離較遠,形成獨立的基因III群,也是目前山東省IBV的主要基因型。S1基因同源性分析結(jié)果表明,分離株與H120和491的同源性分別在65.5% ~99.3%和65.4% ~78.5%之間;以H120為參考株,多數(shù)分離株都存在著氨基酸的插入現(xiàn)象,其中CK/CK/SD09/005在98-99(G)、142-143(S)、288-289(QKEP),375-376(S)位核苷酸處共插入了7個氨基酸,由于廣泛的基因突變和多個氨基酸的插入,分離株CK/CK/SD09/005除與TC07-2同源性較高(98.7%)外,與Gen-Bank上登錄的IBV序列同源性均低于70%。此外,CK/CK/SD09/005與H120和491的S1基因同源性分別為65.5%和65.4%,抗原相關(guān)系數(shù)分別為18%和9%,因此推測CK/CK/SD09/005可能源自疫苗株和野毒株之間的基因重組。

    雞胚中和試驗和抗原相關(guān)系數(shù)計算結(jié)果發(fā)現(xiàn):IBV疫苗株和部分分離株之間僅能發(fā)生單向中和試驗或能夠雙向交叉中和的毒株之間抗原相關(guān)系數(shù)小于25%(屬于不同血清型),說明IBV存在多個中和性抗原表位,可以通過部分中和表位的改變產(chǎn)生新的血清型。8個IBV分離株中,僅有SDWF0608、SDLY0612、SDLY0701三個分離株與疫苗株H120同屬Mass血清型的不同亞型,其它5個分離株與H120和491屬于不同的血清型,抗原相關(guān)性均低于25%,本研究結(jié)果從體液免疫的角度解釋了臨床上雞群免疫H120或491疫苗后仍然經(jīng)常發(fā)生IBV感染的原因,也提示山東省目前IBV流行株存在多個血清型,必須在全面鑒定這些流行株血清型的基礎(chǔ)上進行多價疫苗的研制。

    結(jié)合S1基因序列同源性和抗原相關(guān)性結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)分離株SDTA06111與H120同屬基因I群,且S1基因核苷酸序列的同源性分別達到99.3%,但是二者抗原相關(guān)系數(shù)僅18%,不屬于同一個血清型;分離株SDLY0612與H120的抗原相關(guān)系數(shù)最高(70.71%),但是兩者S1基因序列的同源性僅78.2%,說明S1基因同源性和血清型沒有明顯的相關(guān)性,IBV可能通過少數(shù)基因突變導(dǎo)致中和性抗原表位的改變,從而產(chǎn)生新的血清型。

    綜上所述,由于IBV基因突變、插入、缺失和重組并不斷產(chǎn)生新的血清型,導(dǎo)致生產(chǎn)上疫苗免疫失敗,必須加強對IBV流行株的監(jiān)測,并采取包括生物安全在內(nèi)的各項綜合防控措施才能有效預(yù)防IB的發(fā)生。

    參考文獻

    [1]King DJ,Cavanagh D.Infectious bronchitis.In:Calnek BW,Barnes HJ,Beard CW,Reid WM,Yoder HW Jr(eds)Diseases of Poultry,9th edn.Iowa State University Press,Ames,1991,471 -484

    [2]Bayry J,Goudar MS,Nighot PK,Kshirsagar SG,Ladman BS,Gelb J Jr,Ghalsasi GR,Kolte GN,Emergence of a nephropathogenic avian infectious bronchitis virus with a novel genotype in India.Clin Microbiol,2005,43:916 -918

    [3]Johnson M A.,Pooley C,Ignjatovic J,et al.A recombinant fowl adenovirus expressing the S1 gene infectious bronchitis virus protects against challenge with infectious bronchitis virus[J].Vaccine,2003(21 -22):2730 -2736

    [4]Cavanagh D.The early history of infectious bronchitis[J].Adv Exp Med Bio,1984,173:95 - 108

    [5]DeWit,J.J.Detection of infectious bronchitis[J].Avian Pathology,2000,29:71 -93

    [6]王晶鈺,李 鵬,倪 斌,等.雞腎型傳染性支氣管炎病毒G118株的分離及鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2006,42(14):19-20

    [7]Lambrecht s C,Pensaert M,Ducatelle R.Challenge experiments to evaluate cross-protection induced at the trachea and kidney level by vaccine strains and Belgian Nephropathogenic isolates of avian infectious bronchitis virus[J].Avian Pathol,1993,22:577 -590

    [8]Cavanagh,D.Coronavirus avian infectious bronchitis virus[J].Vet.Res.2007,38:281 297

    [9]Kant A,Koch G,van Roozelaar DJ,et al.1992.Location of antigenic sites defined by neutralising monoclonal antibodies on S1 avian infectious bronchitis virus glycopolypeptide [J].J Gen Virol 73:591-596

    [10]Linlin Li,Chunyi Xue,F(xiàn)eng Chen,et al.Isolation and genetic analysis revealed no predominant new strains of avian infectious bronchitis virus circulating in South China during 2004 – 2008[J].Vet.Microbiol.2009

    猜你喜歡
    核苷酸血清型毒株
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進展
    徐長風(fēng):核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    法國發(fā)現(xiàn)新冠新變異毒株IHU
    Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
    通遼地區(qū)牛肉與牛肉制品沙門氏菌血清型調(diào)查
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:44
    廣西鴨圓環(huán)病毒流行毒株遺傳變異分析
    廣東地區(qū)水禽大腸桿菌血清型鑒定
    牛傳染性鼻氣管炎IBRV/JZ06-3基礎(chǔ)毒株毒力返強試驗
    肺炎鏈球菌血清型鑒定的分子生物學(xué)檢測方法
    廣東人群8q24rs1530300單核苷酸多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂的相關(guān)性研究
    芮城县| 班戈县| 兴和县| 改则县| 许昌县| 乃东县| 青冈县| 闸北区| 理塘县| 偏关县| 衡东县| 东兴市| 凤凰县| 安乡县| 娄底市| 鹤山市| 辉县市| 广饶县| 南川市| 九龙城区| 乡城县| 宾川县| 清水县| 陇南市| 比如县| 上高县| 宜昌市| 法库县| 张家港市| 富锦市| 延庆县| 家居| 肃南| 杂多县| 若尔盖县| 仁化县| 巴林左旗| 汾阳市| 扎鲁特旗| 鸡西市| 绥德县|