添加不同水平煙酰胺對(duì)泌乳奶牛體外發(fā)酵的影響

顏 妍，林雪彥，王 云，王中華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018)

維生素PP為水溶性B族維生素的一種，包括煙酸(NA)和煙酰胺(NAM)兩種形式，為輔酶Ⅰ(NAD)和輔酶Ⅱ (NADP)的直接前體，在代謝中起重要的作用［1］。NA和NAM都能轉(zhuǎn)化到輔酶上，但只有NAM是有活性的部分，在動(dòng)物體內(nèi)，NA易轉(zhuǎn)變成具有生物活性的NAM［2］。奶牛維生素PP來(lái)源除了有天然飼料和體內(nèi)色氨酸的轉(zhuǎn)化合成以外，瘤胃微生物的合成也是其重要的來(lái)源。前人的研究認(rèn)為反芻動(dòng)物瘤胃合成的維生素PP即可滿足機(jī)體需要，不必考慮額外添加［3］，而后期又有研究表明，通過(guò)補(bǔ)飼維生素PP后，產(chǎn)奶量提高了［4，5］，但是NAM影響產(chǎn)奶量的機(jī)理還不清楚。維生素PP在瘤胃液中的濃度可能影響微生物菌體蛋白產(chǎn)量［6，7，8］及微生物菌群，特別是原生動(dòng)物［6，7，9，10］，因此，添加維生素 PP，能夠影響微生物發(fā)酵，但在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加NAM后對(duì)瘤胃各發(fā)酵指標(biāo)有何影響及適宜的NAM添加量依然沒(méi)有明確結(jié)論。本文以常規(guī)日糧作為基礎(chǔ)發(fā)酵底物，采用體外培養(yǎng)的方法，通過(guò)觀察在一定基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上，添加不同水平NAM對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，研究NAM增加產(chǎn)奶量的機(jī)理，尋找適合瘤胃微生物生長(zhǎng)的最適濃度，為實(shí)際生產(chǎn)中確定補(bǔ)飼NAM的劑量做基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選取3頭裝有永久性瘤胃瘺管的荷爾斯坦奶牛，泌乳天數(shù)為120 d，平均產(chǎn)奶量為20 kg/d，作為瘤胃液供體。

參照NRC(2001)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制TMR基礎(chǔ)日糧，單槽飼喂，每日飼喂2次，試驗(yàn)期間奶牛自由飲水，每天擠奶2次?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Ingredient and nutrient composition of basal diet(DM basis)%

1.2 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)底物

試驗(yàn)用煙酰胺(含量99.5%)為飼料級(jí)維生素，白色細(xì)小粉末，購(gòu)自比利時(shí)Vertellus Specialties公司，登記證號(hào)為(2008)外飼準(zhǔn)字122號(hào)。

試驗(yàn)底物參照飼料配方，苜蓿、青貯、精料分別為0.5 g，3.5 g，6 g。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素重復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每種處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。使用250 mL廣口試劑瓶作為發(fā)酵瓶，瓶塞采用設(shè)有三個(gè)通路的橡皮塞，一個(gè)持續(xù)供應(yīng)二氧化碳，一個(gè)進(jìn)行氣體交換，一個(gè)作為取樣通路。處理分別為A:底物+0 mg NAM;B底物+3 mg NAM;C底物+6 mg NAM;D底物+9 mg NAM;E底物+12 mg NAM。

1.4 體外發(fā)酵混合物配制

參照馮仰廉《反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)》［11］。

1.4.1 人工唾液的配制 常量元素溶液:Na2HPO45.7 g。KH2PO46.2 g。MgSO40.6 g。加蒸餾水至1L。微量元素溶液:CaCl2·2H2O 16.12 g。MnCl2·4H2O 10.0 g。CoCl2·6H2O 1.0 g。FeCl3·6H2O 0.8 g。加蒸餾水至 1L，緩沖溶液(PH 7.0 ～7.3):NaHCO335 g。NH4HCO34 g。加蒸餾水至1L，刃天青溶液:100 mg刃天青加蒸餾水至100 mL 1M NaOH溶液:40 g NaOH定容至1000 mL

人工唾液由蒸餾水、常量元素溶液、微量元素溶液、緩沖液、指示劑溶液和還原性溶液配成。各種溶液的配制如下:將常量元素溶液480 mL、微量元素溶液0.24 mL、緩沖液480 mL、100 mg/mL刃天青溶液2.44 mL以及950 mL蒸餾水混合置于三角瓶中，水浴加熱至39℃后，一邊震蕩一邊加入1.0 M NaOH溶液4.0 mL、Na2S·9H2O 672 mg以及95 mL蒸餾水混合而成的還原液，同時(shí)充入CO2，直至溶液顏色由藍(lán)變至粉紅色最后變?yōu)闊o(wú)色透明，表明人工唾液已呈還原狀態(tài)。將該人工唾液放到39℃水浴待用。

1.4.2 瘤胃液的制備 在試驗(yàn)牛晨飼2 h后，用吸管從瘤胃腹囊的不同位點(diǎn)快速采集瘤胃液，放入經(jīng)預(yù)熱達(dá)到39℃并通有二氧化碳的保溫瓶中，經(jīng)4層紗布過(guò)濾于三角瓶，39℃水浴保溫并持續(xù)通CO2直至分裝使用。

1.5 培養(yǎng)及取樣

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g發(fā)酵底物放于標(biāo)記好的尼龍袋中，放入發(fā)酵瓶，將盛有尼龍袋的發(fā)酵瓶在39℃預(yù)熱15 min，然后向每個(gè)發(fā)酵瓶?jī)?nèi)加入180 mL瘤胃液與人工唾液的混合液(瘤胃液與人工唾液體積比為1:2)，然后在水浴搖床上培養(yǎng)，水溫控制在39℃，培養(yǎng)開(kāi)始后1 h內(nèi)持續(xù)向發(fā)酵瓶中充CO2。在2、4、6、8、12、24 h各取10 mL發(fā)酵液立即測(cè)定pH，并－20℃保存，用于氨氮、揮發(fā)性脂肪酸、菌體蛋白的測(cè)定。

1.6 測(cè)定指標(biāo)

1.6.1 pH值 發(fā)酵液pH值用UB－7型pH計(jì)于發(fā)酵試驗(yàn)各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)取樣后立即測(cè)定并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.6.2 氨氮(NH3－N)濃度 采用苯酚－次氯酸鈉比色法(Broderick和Kang，)［12］。

1.6.3 揮發(fā)性脂肪酸濃度 采用氣相色譜法(日本島津，Shimadzu，GC－9A)外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。

1.6.4 微生物蛋白的分離測(cè)定 參考Martin－Orue﹠Balcells［13］和王夢(mèng)芝［14］。

原蟲(chóng):取體外發(fā)酵混合物加等體積生理鹽水39℃水浴震蕩(125 r/min)培養(yǎng)60 min，并輔以攪拌;再經(jīng)4層紗布過(guò)濾，濾液離心(150 g，10 min)，收集沉淀為原蟲(chóng)，用生理鹽水洗滌兩次后用生理鹽水懸浮，－20℃貯存待測(cè)。

細(xì)菌:收集原蟲(chóng)液離心后上清，再高速離心(20000 g，15 min)，收集沉淀為細(xì)菌，其余處理同原蟲(chóng)。

微生物蛋白的測(cè)定:采用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白法(AOAC，1990)。取分離微生物樣品經(jīng)20000×g，離心10 min，棄上清液加入5 mL 10%TCA，混勻后置于室溫下30 min，6000×g離心10min，棄上清液再加入5 mL 5%NaOH混勻溶解后，6000×g離心10 min，取上清液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD280nm和OD260nm。計(jì)算公式:Pr(mg/mL)=(1.45×OD280－0.740×OD260)×D。式中D為稀釋倍數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excell進(jìn)行整理，應(yīng)用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA程序進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)用Duncan氏法進(jìn)行各組間的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物pH值的影響

不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物pH值的影響如表2所示。

表2 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物pH值的影響Table 2 Effect of different nicotinamide supplement levels on pH value of medium

從表2中可以看出，在發(fā)酵4 h內(nèi)，pH值沒(méi)有顯著的變化(P＞0.05)，在發(fā)酵8 h后，對(duì)照組和添加12 mg/100 g NAM組顯著下降，低于添加6和9 mg/100 g NAM組(P＜0.05);在發(fā)酵24 h后，各組pH值均降低，差異不顯著(P ＞0.05)。

2.2 不同煙酰胺添加水平對(duì)底物干物質(zhì)、蛋白、NDF降解率的影響

不同煙酰胺添加水平對(duì)底物干物質(zhì)、蛋白、NDF降解率的影響如表3所示。

表3 不同煙酰胺添加水平對(duì)底物干物質(zhì)、蛋白、NDF降解率的影響Table1 3 Effect of different nicotinamide supplement levels on digestibility of dry matter，protein and NDF of substrate

從表3中可以看出，不同添加水平的煙酰胺對(duì)干物質(zhì)、蛋白、中性洗滌纖維降解率差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物NH3－N濃度的影響

不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物NH3－N濃度的影響如表4所示。

表4 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物NH3－N濃度的影響Table1 4 Effect of different nicotinamide supplement levels on concentration of NH3－N of medium

從表4中，我們可以看出，發(fā)酵2 h后，添加9 mg/100 g NAM組氨氮濃度顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，其他各組與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05);發(fā)酵4 h后，添加6和12 mg/100 g NAM組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);發(fā)酵8 h后，添加9和12 mg/100 g NAM組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);發(fā)酵12 h后，添加12 mg/100 g NAM組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，添加6 mg/100 g NAM組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);對(duì)其均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，添加12 mg/100 g NAM組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，其他各組與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物VFA濃度的影響

不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物VFA濃度的影響如表5所示。

表5 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵12 h混合物VFA濃度的影響Table1 5 Effect of different nicotinamide supplement levels on concentration of VFA of medium in 12 hours

如圖5所示，各組乙酸、丙酸、丁酸及總揮發(fā)性脂肪酸濃度差異不顯著(P＞0.05)，但是從數(shù)值上看，乙酸濃度以及總揮發(fā)性脂肪酸濃度隨煙酰胺濃度梯度的升高而增加，但差異不顯著(P＞0.05)。

2.5 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物菌體蛋白的影響

表6 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物菌體蛋白的影響Table1 6 Effect of different nicotinamide supplement levels on concentration of MCP of mediumin 12 hours

如表6所示，從原蟲(chóng)蛋白濃度來(lái)看，添加9和12mg/100 g NAM組顯著低于其他三組，而添加3和6mg/100 g NAM組從數(shù)值上高于對(duì)照組，差異不顯著(P＜0.05)。

3 討論

3.1 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物pH值的影響

瘤胃pH值的正常變化范圍是5.5～7.5，pH值過(guò)高或者過(guò)低對(duì)瘤胃微生物生長(zhǎng)、繁殖及底物發(fā)酵均造成不利的影響。當(dāng)pH值低于下限時(shí)，瘤胃內(nèi)的微生物活力降低，數(shù)量減少或完全被酸性環(huán)境殺死［15］。就本實(shí)驗(yàn)而言，發(fā)酵4 h內(nèi)，pH值均在6.51～6.67之間，沒(méi)有顯著的變化，在8 h、12 h后，對(duì)照組和E組出現(xiàn)了pH值較大的下降幅度，12 h后已處于pH值下限，不適于微生物的生長(zhǎng)。較高或者較低的瘤胃煙酰胺濃度均不適應(yīng)微生物的生長(zhǎng)。pH值變化的原因可能是過(guò)高或者過(guò)低的煙酰胺濃度會(huì)影響瘤胃中氨氮的濃度和揮發(fā)性脂肪酸的濃度，進(jìn)而影響pH值。在發(fā)酵24 h時(shí)，各組pH值均處于下限水平，發(fā)酵已經(jīng)處于非正常狀態(tài)。因此，體外發(fā)酵其他指標(biāo)只測(cè)定12 h之內(nèi)的數(shù)據(jù)。

3.2 不同煙酰胺添加水平對(duì)底物干物質(zhì)、蛋白、中性洗滌纖維降解率的影響

有研究學(xué)者提出，維生素PP可提高日糧干物質(zhì)降解率［16］粗蛋白質(zhì)消化率［17］和中性洗滌纖維降解率［16－18］，原因可能為添加維生素PP后，提高了纖維素酶活和原蟲(chóng)數(shù)量［18］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然添加NAM組原蟲(chóng)數(shù)目增加了，但是不同煙酰胺添加水平對(duì)干物質(zhì)、蛋白和中性洗滌纖維降解率無(wú)顯著影響，可能與體外培養(yǎng)方法的局限性有關(guān)，也可能與發(fā)酵時(shí)間(12 h)有關(guān)。

3.3 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物NH3－N濃度的影響

NH3－N是瘤胃發(fā)酵的主要氮源。一些體內(nèi)試驗(yàn)(19，20，21)表明維生素PP對(duì)瘤胃中的NH3－N濃度沒(méi)有影響，其他體外(8)和體內(nèi)(6，7)研究表明，維生素PP能夠減少瘤胃NH3－N濃度。NH3－N濃度為2－10 mg/dl時(shí)為微生物的生長(zhǎng)最適濃度，在體外試驗(yàn)中當(dāng)NH3－N濃度高于5 mg/dl時(shí)，MCP合成效率不受氮濃度的影響［22］。本研究中NH3－N濃度均高于此值。在體內(nèi)，當(dāng)降解氮數(shù)量超過(guò)微生物利用量時(shí)，在瘤胃內(nèi)超過(guò)微生物利用量的NH3經(jīng)瘤胃壁吸收進(jìn)入尿氮循環(huán)，一部分經(jīng)尿液排除體外，另一部分經(jīng)唾液重新進(jìn)入瘤胃，但是體外培養(yǎng)無(wú)此機(jī)能，可能是NH3－N濃度比正常值高的原因［23］。

3.4 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物VFA濃度的影響

NAM可能影響碳水化合物發(fā)酵，究其原因，維生素PP可能對(duì)微生物菌落有影響。原蟲(chóng)數(shù)目增加時(shí)，丙酸含量增加［9，16］，丁酸含量增加［9，24］，但是這也出現(xiàn)了不一致的情況，較高的原蟲(chóng)數(shù)目伴隨著丙酸丁酸比例的降低［7］，由此，不能確定碳水化合物的改變與瘤胃原蟲(chóng)數(shù)目直接的關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然原蟲(chóng)數(shù)目提高了，但是VFA含量沒(méi)有顯著性的變化，可能與發(fā)酵時(shí)間有關(guān)，有研究學(xué)者得出VFA含量與發(fā)酵時(shí)間有直接關(guān)系［25］，可能也與物種和瘤胃液本底維生素PP濃度有關(guān)。

3.5 不同煙酰胺添加水平對(duì)體外發(fā)酵混合物菌體蛋白的影響

在體外［8］和體內(nèi)［6，7］觀察維生素PP可以刺激微生物蛋白質(zhì)合成，補(bǔ)充維生素PP刺激了原蟲(chóng)生長(zhǎng)，提高原蟲(chóng)數(shù)量和密度［9，25］。因此，補(bǔ)飼維生素PP后通過(guò)影響微生物菌群而影響瘤胃氮代謝。本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，原蟲(chóng)蛋白含量顯著提高了，但是細(xì)菌蛋白含量沒(méi)有顯著影響，與上述研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

NAM對(duì)瘤胃pH有顯著影響，添加6 mg和9 mg NAM適于微生物生長(zhǎng)，不添加NAM和高劑量NAM均不適于微生物正常生長(zhǎng);

NAM對(duì)干物質(zhì)、蛋白、中性洗滌纖維的降解率并無(wú)顯著影響;對(duì)VFA濃度影響不顯著，可能原蟲(chóng)數(shù)目的增加不是影響VFA的主要原因;

添加3和6mg/100 g NAM組可刺激瘤胃原蟲(chóng)的生長(zhǎng)，增加瘤胃菌體蛋白的量，添加9和12mg/100 g NAM 組抑制瘤胃原蟲(chóng)生長(zhǎng)，降低瘤胃菌體蛋白的量;NAM刺激瘤胃原蟲(chóng)的生長(zhǎng)，可能是添加NAM增加產(chǎn)奶量的原因，但是高劑量可能起到相反的效果。

因此，泌乳奶牛日糧中應(yīng)該添加煙酰胺，建議在基礎(chǔ)日糧水平下，適宜的添加量為6 mg/100 g。但是泌乳奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，受多種因素影響，生產(chǎn)中應(yīng)該進(jìn)一步試驗(yàn)得到適宜的添加量。

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