超表達(dá)OsSsr1基因增強(qiáng)煙草耐鹽性

封 偉，肖姍姍，常閃閃，劉鳳權(quán)，邵 敏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問(wèn)題。在世界范圍內(nèi)，灌溉土地的1/3受到鹽分脅迫，并且過(guò)量的灌溉及降雨的缺乏等一系列因素加劇了鹽漬化程度，使土地鹽漬化面積逐年增加，已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的制約因素［1］。當(dāng)前，研究植物鹽脅迫分子機(jī)制，尋找提高植物耐鹽脅迫方法、培育耐鹽植株，成為科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)［2］。

OsSsr1基因是一個(gè)未知功能基因。本實(shí)驗(yàn)室將Harpin蛋白編碼基因hrf1基因轉(zhuǎn)入水稻獲得的轉(zhuǎn)基因系NJH12具有對(duì)干旱等非生物脅迫和生物脅迫的耐性［3］。在NJH12的表達(dá)譜中，發(fā)現(xiàn)OsSsr1基因表達(dá)上調(diào)2.8倍，可能與植物的逆境脅迫反應(yīng)有關(guān)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來(lái)自水稻Os-Ssr1基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)OsSsr1的超表達(dá)促進(jìn)了脯氨酸的積累和活性氧清除能力的提高，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)NaCl的耐受能力。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因受體煙草:本氏煙(Nicotiana benthamiana)。

植物雙元表達(dá)載體pVec8由江蘇省農(nóng)科院楊杰副研究員提供。在pVec8的BamHI和KpnI兩個(gè)酶切位點(diǎn)間加入水稻OsSsr1基因，構(gòu)建載體pVOsSsr1(圖1)，并將其導(dǎo)入土壤根癌桿菌LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)，用于轉(zhuǎn)化煙草。

圖1 煙草轉(zhuǎn)基因載體pVOsSsr1示意圖Fig.1 Schematic diagram of plant expression plasmid pVOsSsr1

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR和 PCR－ Southern分析 用Trizol Reagent(Invitrogen)提取煙草總RNA［4］。根據(jù)OsSsr1的cDNA 序列設(shè)計(jì)引物OsSsr1－F2:5＇－ TGTTCATTGCCGGAGTTACCAAGTA －3＇;OsSsr1 －R2:5＇－ TTCAACCACGC CCAAGTCCAT－3＇，用于 RT－ PCR 反應(yīng)用One Step RNA PCR Kit(Takara，大連)進(jìn)行RT－ PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體積為50 μL，RNA 量1 μg，10 μM 的上下游引物各 2 μL，RNA 酶抑制劑 40 U，10 × Buffer 5 μL，25 mM的MgCl210 μL，10 mM 的 dNTP Mixture 5 μL，MAV 反轉(zhuǎn)錄酶5 U。反應(yīng)條件:50℃，30 min;94℃，2 min;94℃，30 s;48℃，30 s;72℃，1 min;30個(gè)循環(huán);延伸72℃，7 min。RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后轉(zhuǎn)至尼龍膜上，用上述進(jìn)行RT－PCR的引物及PCR DIG探針合成試劑盒(Roche公司)標(biāo)記相應(yīng)的cDNA為探針，按照Engler－Blum［5］描述的方法進(jìn)行Southern雜交，檢測(cè)尼龍膜上的PCR產(chǎn)物。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得 通過(guò)土壤根癌桿菌介導(dǎo)的方法，由潮霉素篩選，分化后獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行分子驗(yàn)證留取陽(yáng)性植株。通過(guò)RT－PCR和PCR－Southern對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株的目的基因進(jìn)行驗(yàn)證，剔除假陽(yáng)性植株。

無(wú)菌條件下將兩個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因株系T1－3，T1－4的種子裝入滅菌1.5 mL EP管中。加入1 mL 30%的雙氧水，放入搖床中180 rpm，28℃消毒10 min。用滅菌水沖洗5次以上，并將轉(zhuǎn)基因種子轉(zhuǎn)入含有40 mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上，26℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。本氏煙野生型(WT)種子經(jīng)消毒后，放入不含潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)皿中，相同條件下培養(yǎng)。將生長(zhǎng)兩周的幼苗移栽到由蛭石固定的花盆中，澆Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。在溫室培養(yǎng)3周，在此期間提取轉(zhuǎn)基因煙草的基因組進(jìn)行PCR篩選。

1.2.3 鹽脅迫處理 兩周齡幼苗鹽脅迫處理:將幼苗轉(zhuǎn)入加有0.2 M NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3天。再將幼苗轉(zhuǎn)入不含NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d觀察拍照。

五周齡植株脅迫處理:把 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的T1－3，T1－4和 WT煙草用0.15 M NaCl處理12 d，分別在處理過(guò)程的第3、6、9、12 d取樣，采用李合生等［6］的方法，測(cè)定煙草葉片中丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量及超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草的檢測(cè)

對(duì)2個(gè)具有潮霉素抗性株系的T1代植株(T1－3，T1－4)及野生型植株(WT)進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖2)，潮霉素抗性植株得到與目的片段(547 bp)大小一致的產(chǎn)物，而野生型植株則無(wú)條帶。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草的RT－PCR(A)和PCR－Southern(B)雜交檢測(cè)Fig.2 RT －PCR(A)and Southern blot analysis(B)of transgenic tobacco plants WT，wild－type;T1－3、T1－4，transgenic tobacco lines

為進(jìn)一步明確擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的基因片段，將電泳分離的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR－Southern雜交，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增得到的特異片段是目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)而說(shuō)明外源基因已整合到煙草基因組中，并遺傳到T1代。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性測(cè)定

煙草在高濃度鹽的脅迫中，葉片都受到損傷而呈現(xiàn)不同程度的黃化、白化，甚至整株死亡。在10天的恢復(fù)后從圖3(A)中看出，轉(zhuǎn)基因煙草的兩個(gè)株系(T1－3，T1－4)大部分有新葉生出，而野生型植株全部白化死亡。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因株系T1－3存活率78%，T1－4存活率62%;野生型煙草(WT)全部死亡。這一結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草具有耐鹽脅迫的能力。

Fig.3 Salt tolerance in transgenic tobacco plants(A)and survival rate(B)WT，wild－type;T1－3、T1－4，transgenic tobacco lines

2.3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草脯氨酸含量的變化

植物在干旱、鹽脅迫下，與環(huán)境形成較高的滲透壓。較高的滲透壓能導(dǎo)致細(xì)胞組分的破壞，而滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效抑制滲透脅迫對(duì)細(xì)胞功能造成的危害［7］。脯氨酸是植物在脅迫下容易積累的一種相容滲透調(diào)節(jié)劑，它能夠提高細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)、保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，減少環(huán)境脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害［8］。從圖4可看出，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草脯氨酸含量都明顯上升，但是轉(zhuǎn)基因煙草的中脯氨酸含量的積累明顯高于野生型煙草。鹽脅迫12 d后，轉(zhuǎn)基因煙草中脯氨酸含量分別是脅迫前的23.75(T1－3)和19.5(T1－4)倍，而野生型煙草中脯氨酸含量只是脅迫前的下的11.6倍，轉(zhuǎn)基因煙草中脯氨酸含量極顯著高于野生型煙草(P ＜0.01)。

圖4 鹽脅迫對(duì)煙草葉片游離脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of salt stress on free proline content of tobacco leaves WT，wild －type;T1 －3、T1 －4，transgenic tobacco lines

2.4 鹽脅迫煙草葉片MDA含量的影響

植物在逆境時(shí)，植物器官特別是膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，功能隨之發(fā)生變化，產(chǎn)生大量自由基，使植物產(chǎn)生膜脂過(guò)氧化作用。積累的膜脂過(guò)氧化物分解的產(chǎn)物為丙二醛(malondialdehyde，MDA)［9］。MDA的積累最終造成細(xì)胞膜功能的傷害和植物正常生長(zhǎng)受到抑制。因此MDA含量被廣泛認(rèn)為是膜脂過(guò)氧化的指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度和植物對(duì)逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱［10］。

圖5中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，煙草MDA的含量呈上升趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因煙草上升較慢。鹽脅迫處理12天后，轉(zhuǎn)基因煙草葉片 MDA含量分別增加38.46%(T1－3)和37.04%(T1－4)，分別是非脅迫下的1.38和1.37倍;而野生型煙草葉片增加了108.33% ，是鹽脅迫前的2.08倍;轉(zhuǎn)基因煙草葉片中 MDA含量明顯低于野生型煙草。這一結(jié)果說(shuō)明，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)OsSsr1基因煙草膜脂過(guò)氧化程度遠(yuǎn)低于野生型煙草，維持了植物正常生理代謝、保證轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽的特性。

圖5 鹽脅迫對(duì)煙草葉片MDA含量的影響Fig.5 Effects of salt stress on MDA content of tobacco leaves WT，wild －type;T1 －3、T1 －4，transgenic tobacco lines

2.5 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草SOD和POD含量的變化

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是細(xì)胞內(nèi)的重要保護(hù)酶，能催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，從而清除超氧陰離子自由基，減少其對(duì)膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，該酶的活性與植物的抗逆性密切相關(guān)［11，12］。從圖6(A)可以看出:在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因煙草中SOD的活性略低于野生型煙草，而在鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草SOD活性升高了，且在處理后第9天達(dá)到最大值:野生型煙草SOD活性上升了130.96%，是脅迫前的2.31倍;轉(zhuǎn)基因的兩個(gè)株系分別上升了 303.85%(T1－3)和314.05%(T1 －4)，分別是脅迫前的4.04 和4.14倍。

圖6 鹽脅迫對(duì)煙草葉片中SOD(A)和POD(B)活性影響Fig.6 Effects of salt stress on SOD(A)and POD(B)activity of tobacco leaves WT，wild－type;T1－3、T1－4，transgenic tobacco lines

過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)是防止膜脂過(guò)氧化的主要酶。從圖6(B)中可以看出，鹽脅迫處理前，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的POD含量基本相同;而隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，盡管兩種煙草的POD含量都呈上升趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因煙草的POD活性明顯升高更快。處理12天后，野生型煙草POD活性上升290.1%，是脅迫前的3.63倍;兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系 POD活性則上升429.43%(T1－3)和380.77%(T1－4)，分別是脅迫前的5.29、4.81 倍。

這些數(shù)據(jù)說(shuō)明OsSsr1基因的在煙草中的表達(dá)提高了細(xì)胞內(nèi)SOD和POD活性，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草清除活性氧的能力。

3 討論

Harpin蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化植物，能夠提高多種植物抗旱性等非生物脅迫耐性［3，13］。本文通過(guò)土壤根癌桿菌介導(dǎo)的方法，把從轉(zhuǎn)hrf1基因水稻的轉(zhuǎn)錄譜中挑選了一個(gè)表達(dá)量上調(diào)的基因OsSsr1轉(zhuǎn)入煙草，提高了煙草植株在鹽脅迫下脯氨酸的積累水平和活性氧清除能力，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。

脯氨酸的積累既能增加胞內(nèi)溶質(zhì)濃度、防止細(xì)胞過(guò)度脫水，也能與滲透條件下急劇增加的氧自由基發(fā)生反應(yīng)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)，清除活性氧的危害［14］。轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比，積累的脯氨酸顯著增多，使轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下能夠維持與外界的滲透壓，保護(hù)植物細(xì)胞的正常功能代謝，抑制滲透脅迫對(duì)細(xì)胞功能造成的危害。說(shuō)明OsSsr1基因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫條件下合成滲透調(diào)節(jié)劑的能力，從而提高了植物的耐鹽性。植物在鹽脅迫下會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧的升高誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，破壞生物膜上酶的空間結(jié)構(gòu)及生物膜的通透性，致使細(xì)胞死亡［15，16］。逆境條件下產(chǎn)生的活性氧對(duì)植物的傷害程度及植物對(duì)逆境的抵抗能力與其體內(nèi)的SOD、POD活性有關(guān)，其活性越高，植物的抗逆性越強(qiáng)［17］。本研究中，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因系和野生型煙草體內(nèi)的MDA含量雖都有不同程度的升高，但轉(zhuǎn)基因株系體內(nèi)的MDA的延長(zhǎng)積累速率明顯低于野生型。與此相應(yīng)，轉(zhuǎn)OsSsr1基因株系在鹽脅迫下SOD和POD活性的升高速率明顯快于野生型植株，說(shuō)明OsSsr1基因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因株系的活性氧清除能力，減緩了鹽脅迫對(duì)植物的傷害。

本研究初步證實(shí)，OsSsr1基因在煙草中的表達(dá)能夠增強(qiáng)煙草植株的耐鹽性，這說(shuō)明是該基因可能在植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)中起重要作用，但OsSsr1在植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的信號(hào)通路中的具體作用，還需要進(jìn)一步研究。

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