大麥TILLING體系在抗病基因研究中的應(yīng)用

胡 鑫，齊新麗，呂 波，吳佳潔，付道林

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東省作物生物學(xué)重點實驗室，作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東泰安 271018)

栽培大麥(Hordeum vulgare L.)是世界上重要的禾谷類作物，其面積和產(chǎn)量分別為55.90百萬公頃和155.34百萬噸，僅次于小麥、玉米和水稻［1］。大麥主要用作飼料，其次(大約15%)用于啤酒釀造及人類食用。大麥和小麥同屬禾本科小麥族(Triticeae)，基本染色體組均包含7個染色體，在基因組成和排列方面高度保守。由于大麥為二倍體，是研究六倍體小麥的重要的模式植物。

TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)是開展反向遺傳學(xué)研究的有效技術(shù)，具有高通量、低成本、不依賴于基因型等特點［2］。TILLING技術(shù)涉及突變?nèi)后w的構(gòu)建和隨機突變的篩選，通常采用甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)誘導(dǎo)突變，利用芹菜內(nèi)切酶CEL I處理鑒定突變位點。Till等人［3］詳細(xì)介紹了TILLING技術(shù)的有關(guān)步驟。CEL I內(nèi)切酶的制備相對簡單［4］，多數(shù)實驗室可以獨立純化CEL I。目前，基于CEL I酶切的TILLING技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多種生物突變?nèi)后w的篩選。隨著深度測序技術(shù)的發(fā)展，人們開始嘗試運用現(xiàn)代測序技術(shù)實現(xiàn)高通量TILLING篩選［5］。TILLING技術(shù)最先應(yīng)用于模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)和果蠅(Drosophila melanogaster)等［6］［7］。目前，國際上該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于水稻［8］、小麥［9］［10］和大麥［11］等多種糧食作物。然而，我國在此領(lǐng)域，尤其是在麥類作物方面，還未建成實用的TILLING篩選平臺。

在擬南芥中，水楊酸(salicylic acid，SA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)等植物激素參與調(diào)控防御反應(yīng)［12］［13］［14］。水楊酸和茉莉酸之間存在協(xié)同和拮抗并存的復(fù)雜調(diào)控關(guān)系，通過與植物免疫信號網(wǎng)絡(luò)的微妙配合，決定植物細(xì)胞的防御效果［15］。水楊酸信號途徑主要調(diào)控對活體寄生的病原菌和病毒的反應(yīng)，而茉莉酸信號途徑主要調(diào)節(jié)對腐生病原菌和昆蟲的抗性［16］［17］。植物促分裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)則對各個信號通路行使重要的調(diào)控作用［18］［19］。擬南芥 EDR1(Enhanced Disease Resistance 1)基因?qū)儆贛APK激酶的一員，位于MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的頂端，對SA抗病途徑具有負(fù)調(diào)控功能［20］。相反，病程相關(guān)基因非表達(dá)子 1(NONEXPRESSOR OF PATHOGENESIS－RELATED GENES 1，NPR1)是水楊酸調(diào)控途徑下游的重要調(diào)控因子，同時協(xié)調(diào)不同植物激素信號通路間的交互效果［13］。研究表明，擬南芥EDR1和NPR1基因在麥類作物中存在同源基因［21］，暗示它們可能參與抗病反應(yīng)，同時也暗示水楊酸是啟動麥類作物防御響應(yīng)的信號分子。

本研究通過構(gòu)建大麥TILLING篩選體系、鑒定大麥EDR1和NPR1基因突變體，探索開展麥類作物功能基因組學(xué)的新思路。

2 材料和方法

2.1 植物材料

本實驗采用六棱春性裸粒大麥(H.vulgare L.cv.‘Tamalpais’)為原始材料創(chuàng)建突變?nèi)后w。CEL I內(nèi)切酶的提取使用山東省泰安市當(dāng)?shù)胤N植的新鮮旱芹材料。

2.2 實驗方法

2.2.1 突變?nèi)后w的創(chuàng)建 大麥種子經(jīng)0.3%(v/v)EMS(Sigma－Aldrich，St.Louis，MO，USA)水溶液震蕩處理10 h(150 rpm，25℃)，隨后使用自來水持續(xù)沖洗4 h，然后置于通風(fēng)櫥吹干備用。M1種子在溫室播種，分單株收獲M2種子。M2種子按株系種植，分別播種4～8粒、從中保留1個M2健壯植株，用以創(chuàng)建TILLING群體。

2.2.2 CELⅠ酶切篩選體系的建立 實驗利用小麥開花基因FT的兩個質(zhì)粒(單堿基差異)作為PCR擴增模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)過CELⅠ酶切和凝膠電泳(瓊脂糖或聚丙烯酰胺)分離，建立篩選體系。模板質(zhì)粒包括FT(12－1)和FT(12－6)，擴增產(chǎn)物長 1427 bp，酶切產(chǎn)生370 bp和1056 bp的片段。擴增引物、差異堿基和省略片段大小如下:

FT(12－1):CACCTCGTACCCTAGCTAGC|350bp|G|1033bp|GTGATAAGAAGCCAGCCACGAAT

FT(12－6):CACCTCGTACCCTAGCTAGC|350bp|T|1033bp|GTGATAAGAAGCCAGCCACGAAT

PCR采用25 μL反應(yīng)體系，包括1×Reaction Buffer(Promega公司Colorless GoTaqReaction Buffer，catalog#M7921)，dNTPs(TaKaRa公司)200 μM，擴增引物各25 pmol，模板 5 ～300 ng，Taq 酶 5U。PCR 反應(yīng)步驟包括:預(yù)變性94℃ 5 min，40個擴增循環(huán)(94℃ 30 s，52.4℃ 30 s，72℃ 1.5 min)，終延伸72℃8 min，退火預(yù)變性99℃ 10 min，80℃ 20 s，95個退火循環(huán)(80℃ 7 s，每循環(huán)溫度遞減0.3℃)，4℃保存。

CELⅠ內(nèi)切酶的提取參照Till等人［4］的方法，所有操作在4℃進(jìn)行。CELⅠ酶切和酶切產(chǎn)物分離參照Uauy 等人［10］的方法。其中，CELⅠ酶切體系20 μL，含有切割緩沖液(20 mM HEPES pH 7.5，10 mM KCl和3 mM MgCl2)2 μL ，CELⅠ酶1 μL ，PCR 產(chǎn)物14 μL ，雙蒸水3 μL 。在45 ℃條件下，酶切30 min，然后加入反應(yīng)終止液(75 mM EDTA pH 8.0)5 μL，在45℃條件下放置2 min。實驗比較分析CELⅠ濃度、酶切溫度和酶切時間等因素對酶切效果的影響，用以優(yōu)化酶切體系。

2.2.3 大麥突變體的篩選 實驗圍繞擬南芥水楊酸抗病信號通路，選擇了上下游2個關(guān)鍵途徑基因EDR1(GenBank:AF305913)和 NPR1(GenBank:ATU76707)開展工作。以上2基因在大麥上保守存在(EDR1:AF305912;NPR1:AM050559)。利用公共數(shù)據(jù)庫，比如 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和HarvEST(http://www.harvest－ web.org/)，獲得了大麥基因的完整信息。利用 Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)進(jìn)行PCR引物設(shè)計。通過PCR擴增、CELⅠ酶切和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定攜帶目的基因突變的DNA混合池(本實驗2154M2株系，每4個 M2株系混合成池，共形成534個DNA混合池)，進(jìn)而檢測M2個體和野生親本DNA混合池擴增產(chǎn)物的酶切效果、確定突變株系。對來自突變個體的PCR擴增產(chǎn)物測序鑒定突變位點，分析其可能的突變效應(yīng)。有關(guān)操作步驟參照Uauy等人［10］的方法。大麥EDR1和NPR1基因的擴增反應(yīng)的退火溫度分別為63.1℃ 和64.7℃，擴增引物和中間片段大小如下:

EDR1(AF305912):CGAAGTGGCTACCTTTGGAC|1606bp|CACCTATCGAGCCGAACCTA

NPR1(AM050559):GAACTAGATCCCCACCACCA|1352bp|GTGGTGTTTTGCATGTGGAGT

3 結(jié)果與分析

3.1 大麥TILLING群體的創(chuàng)建

根據(jù)我們使用EMS處理二倍體小麥的經(jīng)驗，選用了0.3%(v/v)EMS處理大麥品種‘Tamalpais’。人工氣候室發(fā)芽一周顯示，經(jīng)EMS處理的種子平均發(fā)芽率63.9%，未處理對照的發(fā)芽率為73.0%;然而幼苗生長狀態(tài)差異明顯，其中EMS處理對應(yīng)的幼苗，生長正常、高于3公分的幼苗占15.3%，而未處理對照正常苗占98.6%。溫室條件下，大約14.3% 的M1個體表現(xiàn)葉片色變(圖1A)。在M2世代，可以看到株高(圖1B)、株型(圖1C)等方面的表型突變(圖1BC)。實驗共收獲2154個M2株系，每4個 M2株系合并成單個DNA池，共形成534個DNA混合池。

圖1 大麥突變體:Fig.1 Barley mutants

3.2 TILLING篩選體系的優(yōu)化

本實驗中CEL I內(nèi)切酶自山東省泰安市當(dāng)?shù)氐暮登壑刑崛。斜匾⑾鄳?yīng)的CELⅠ酶切體系。為此，實驗首先利用攜帶單堿基差異的FT基因質(zhì)粒(1:1混合)測試了酶切溫度和酶切時間對酶切的影響。采用30 min的酶切時間，溫度梯度實驗(圖2A)顯示，溫度低于31.8℃時，酶切特征條帶(370 bp和1056 bp)不明顯，說明在此溫度下CELⅠ內(nèi)切酶活性低，不能有效切割錯配(mismatch)雜合雙鏈。溫度從33.7℃上升到49.7℃，CELⅠ表現(xiàn)活性增加，可以明顯觀察到酶切特征條帶;隨著酶切活性增加，泳道背景信號放大(smear現(xiàn)象)。實驗證明，酶切溫度介于43.9℃到46.8℃范圍內(nèi)較為合適。在酶切時間方面，我們設(shè)定了30到180 min的范圍(圖2B)。采用45℃的酶切溫度，結(jié)果證明，30 min的酶切就能獲得清晰的酶切特征條帶，隨著時間延長，酶切特征條帶增強，但泳道背景信號也逐漸放大。因此，酶切時間在30到75 min較為合適。另外，我們還發(fā)現(xiàn)CELⅠ粗提產(chǎn)物的用量、酶切緩沖液(Nicking Buffer)組分等對CELⅠ酶切效果同樣有影響。對于不同批次提取的CELⅠ內(nèi)切酶，需要對最佳使用濃度進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，建立了有效的酶切體系(酶切溫度45℃，酶切時間30 min，酶切緩沖液(20 mM HEPES pH 7.5，10 mM KCl和 3 mM MgCl2)2 μL。

為驗證本實驗TILLING檢測體系的靈敏度，我們利用攜帶單堿基差異的FT基因質(zhì)粒作為模板，按1∶1到1∶15比例混合，經(jīng)PCR擴增和CELⅠ酶切發(fā)現(xiàn)，1∶1到1∶9的混合模板均可以檢測到清晰的酶切特征條帶;而1∶10到1∶15混合范圍內(nèi)，酶切特征條帶相對模糊(圖2C)。因為大麥為二倍體，1∶3、1∶5、1∶7和1∶9的質(zhì)粒比例相當(dāng)于單個大麥雜合突變個體分別和1、2、3和4個野生型大麥個體等量混合。由此可見，4株 M2個體的DNA混合池可以保證檢測到突變基因。

圖2 TILLING篩選體系的優(yōu)化Fig.2 Optimization of TILLING screening system

3.3 大麥EDR1和NPR1基因突變體篩選

本實驗利用優(yōu)化的CELⅠ酶切體系，對建成的大麥EMS誘變?nèi)后w開展了突變體篩選。實驗針對水楊酸信號通路相關(guān)的2個重要基因EDR1和NPR1。CELⅠ酶切顯示(圖3AB)，現(xiàn)有的2154個M2大麥株系中，鑒定出5個目標(biāo)基因的突變體，其中EDR1突變體3個(210－2、255－3、261－4)、NPR1突變體2個(340－4、360－1)。序列分析證明，EDR1和NPR1基因各有1個突變發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域(255－3、340－4)，分別涉及T→C和G→A轉(zhuǎn)換(Transition)。另外3個突變發(fā)生在外顯子編碼區(qū)，EDR1基因的2個轉(zhuǎn)換C1051T和C1666T分別導(dǎo)致His351Tyr和Pro556Ser突變(圖3CD)，而NPR1基因的G792A轉(zhuǎn)換則不改變Arg編碼(圖3E)。

圖3 大麥EDR1和NPR1基因突變體篩選Fig.3 Screening of EDR1 and NPR1 mutants in Barley population

4 討論

4.1 TILLING技術(shù)在麥類作物功能基因組研究中的應(yīng)用

麥類作物是世界上重要的糧食作物，其功能基因組研究對全球糧食安全具有重要意義。然而，麥類作物對遺傳轉(zhuǎn)化的排斥(recalcitration)嚴(yán)重阻礙著相關(guān)功能基因組研究。TILLING是近年發(fā)展起來的重要的反向遺傳學(xué)研究工具，在動植物研究中都有應(yīng)用［4］。麥類作物方面，TILLING技術(shù)已成功應(yīng)用于小麥［9］［10］和大麥［11］。Slade等人［9］從1920 個小麥突變個體中篩選到 246 個影響直鏈淀粉合成的 WAXY 基因突變，提供了豐富的等位基因資源。Uauy等人［10］也創(chuàng)建了多倍體小麥的TILLING群體，已成功用于研究小麥條銹病抗性基因 WKS1［22］和淀粉分支酶基因 SBEIIa和SBEIIb。在大麥上，德國學(xué)者Gottwald等［11］創(chuàng)建了二棱大麥‘Barke’的TILLING群體，被成功用來研究決定大麥穗形的homeobox基因HvHox1。該大麥突變?nèi)后w在M2和M3世代呈現(xiàn)豐富的形態(tài)變異，同時為開展正向遺傳學(xué)研究提供了寶貴資源。在我國，尚沒有大麥TILLING群體的報道。本研究構(gòu)建了六棱大麥‘Tamalpais’的EMS突變?nèi)后w。本研究為我國麥類作物反向遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

4.2 水楊酸信號通路相關(guān)基因突變體的獲得

在模式植物擬南芥上，水楊酸介導(dǎo)的防衛(wèi)信號途徑在抵御活體寄生的病原菌和病毒抗性方面起著重要作用［14］［16］。盡管水楊酸被證明是雙子葉植物中的重要防御信號，他們在單子葉植物特別是麥類作物中的作用尚不明確。水楊酸或其類似物INA或BTH可以誘導(dǎo)小麥［23］［24］和大麥［25］［26］中病程相關(guān)蛋白基因(pathogenesis－related，PR)的表達(dá)或提高抗性。擬南芥AtNPR1基因是水楊酸信號通路中的重要調(diào)控元件［27］。AtNPR1基因在小麥中的過量表達(dá)增強小麥對赤霉病菌的抗性［28］。因此，水楊酸信號通路在麥類作物抗病方面或許行使重要功能。

EDR1和NPR1是擬南芥水楊酸信號通路中的兩個重要基因［13］［20］。在麥類作物上，EDR1和NPR1基因保守存在，但二者的具體功能還沒有深入的研究。本研究獲得了EDR1和NPR1基因的5個突變體，其中2個EDR1突變導(dǎo)致氨基酸轉(zhuǎn)換(His351Tyr，Pro556Ser)，其他3個突變發(fā)生在內(nèi)含子或不影響氨基酸編碼。鑒于His351Tyr和Pro556Ser突變位于EDR1蛋白的非保守區(qū)段，很難預(yù)測此突變的功效，我們將研究突變體對大麥銹病和白粉病等生物脅迫的反應(yīng)，進(jìn)而推斷大麥EDR1基因的功能。

4.3 群體突變頻率

植物倍性不同，對突變的承載能力各異。在麥類作物上，小麥具有較強的耐突變能力，現(xiàn)有的六倍體小麥TILLING群體平均每24或38 kb一個點突變;相應(yīng)的四倍體小麥 TILLING群體平均每40或51 kb一個點突變［9］［10］。按照六倍體和四倍體小麥平均每38和51 kb一個點突變，對應(yīng)1.3 kb的目標(biāo)片段，從1536個突變個體中可獲得52個六倍體或39個四倍體目標(biāo)基因突變體，含有敲除(knockout)突變的可能性在80%以上［10］。大麥?zhǔn)嵌扼w，TILLING群體的突變頻率相對較低，大約每500 kb一個點突變［11］。

本項研究中，EDR1和NPR1基因的篩選目標(biāo)片段分別為1.6 kb和1.4 kb，因為本實驗采用常規(guī)聚丙烯酰氨凝膠分離CELⅠ酶切產(chǎn)物，片段兩端0.25 kb內(nèi)的錯配將超出檢測范圍，因此兩基因篩選的有效目標(biāo)片段累計2 kb?，F(xiàn)有群體包括2154個M2株系，根據(jù)獲得的5個突變體推斷現(xiàn)有群體平均862 kb一個點突變。同Gottwald等［11］報道的每500kb一個點突變相比，本研究中獲得的EDR1和NPR1基因的突變體數(shù)目偏少，這可能主要是由于引物的擴增效率有關(guān)，導(dǎo)致部分突變體漏選。

5 結(jié)論

本研究創(chuàng)建了大麥品種‘Tamalpais’的TILLING篩選群體，并成功用于水楊酸信號通路中重要基因EDR1和NPR1突變體的篩選。本研究在國內(nèi)領(lǐng)先搭建了大麥反向遺傳學(xué)研究的平臺，為麥類作物功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)。

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