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    脂血和溶血對HBV DNA 實時熒光定量PCR 檢測的影響

    2012-07-16 09:57:30張翠莉魏文波
    武警醫(yī)學 2012年2期
    關鍵詞:脂血乳糜定量

    張翠莉,劉 萍,魏文波

    臨床標本不僅種類多樣,如血清、血漿、膿液、腦脊液、痰、分泌物等,并且同類型標本也可有不同的性質(zhì),如血清標本會有不同程度的溶血、脂血標本等。筆者利用實時熒光定量PCR 方法檢測不同程度脂血、溶血標本中乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)的結果,并進行統(tǒng)計學分析,以研究脂血、溶血是否影響熒光定量PCR 擴增HBV DNA 結果。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑 熒光定量PCR 儀(型號:DA7600,中山大學達安基因股份有限公司);HBV DNA 試劑(達安基因有限公司,批號2010004);日立7180 全自動生化儀;紫外可見分光光度計;三酰甘油(triglyceride,TG)生化試劑(浙江伊利康生物技術有限公司,批號為20100105)。

    1.2 標本采集

    1.2.1 研究乳糜狀脂血因素實驗的標本收集 收集武警四川總隊醫(yī)院2010-04 至2010-05 血脂正常、無溶血的HBV DNA 血標本共30 例,每例采集血液3 ml。根據(jù)HBV DNA 濃度將所收集的30 例標本分為兩個水平:中高HBV DNA 濃度,即HBV DNA≥1.0 ×105標本15 例,設定為Ⅰ水平;HBV DNA 臨界濃度1.0 ×103至1.0 ×104標本15 例,設定為Ⅱ水平。收集乙肝表面抗體(HBsAb)陽性或兩對半全陰性、肝功能正常、無溶血的重度乳糜狀脂血標本及正常人血清標本各5 例,每例采集血液3 ml,及時分離血清,-20 ℃保存。

    1.2.2 研究溶血因素實驗的標本收集 收集臨床乙肝患者無脂血、無黃疸血標本30 例,每人同時采集3 管,每管3 ml,其中兩管-20 ℃冷凍不同時間致不同程度溶血[1],留做平行實驗。

    1.3 方法

    1.3.1 實驗設計 設計不同血脂(三酰甘油)濃度和不同溶血程度的標本,并研究兩種因素對熒光定量PCR 測定兩個水平HBV DNA 結果是否有影響。

    1.3.2 標本制作

    1.3.2.1 兩種水平HBV DNA 不同TG 濃度標本的制作 (1)按照HBV DNA 濃度將臨床收集的標本分為兩個水平,分別為中高濃度HBV DNA≥1.0×10515 份(Ⅰ水平);臨界濃度,HBV DNA 介于1.0 ×103~1.0 ×10415 份(Ⅱ水平)。(2)按照美國國家膽固醇教育計劃的成人治療專家組Ⅲ(NCEPATP Ⅲ)血脂標準,結合本實驗,制作3 種TG 濃度梯度標本,極高TG 濃度脂血(TG≥5.64 mmol/L,A組)、高TG 濃度(TG 2.26 ~5.63 mmol/L,B 組)及正常血脂濃度標本(C 組)。(3)將所收集的重度乳糜狀的脂血標本混勻,進行TG 檢測,TG 為13.88 mmol/L;(4)HBV DNAⅠ水平不同濃度TG 標本的制作:AⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =1∶0∶1。BⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清:HBV DNAⅠ水平 =0.5∶0.5∶1。CⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =0∶1∶1。(5)HBV DNAⅡ水平不同濃度TG 標本的制作:AⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =1∶0∶1。BⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平=0.5∶0.5∶1。CⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =0∶1∶1。

    1.3.2.2 兩種水平HBV DNA 不同溶血程度標本制作 采用-20 ℃冰箱冷凍不同時間,導致標本不同程度溶血,利用分光光度計氰化高鐵血紅蛋白測定法,檢測血紅蛋白濃度,從而將溶血標本分為重度溶血組(血紅蛋白>5.0 g/L,D 組)、輕中度溶血組(0.8g/L <血紅蛋白<5.0 g/L,E 組)[1]、無溶血組(F 組)。(1)HBV DNAⅠ水平3 種溶血標本,即:DⅠ組、EⅠ組、FⅠ組;(2)HBV DNAⅡ水平3 種溶血標本,即:DⅡ組、EⅡ組、FⅡ組。

    1.3.3 HBV DNA 提取和檢測 參照達安基因公司試劑盒說明書進行,待測標本與室內(nèi)質(zhì)控標本同時進行檢測。

    1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,對三組標本PCR 結果取對數(shù)(Log10)進行數(shù)據(jù)轉換,其結果符合正態(tài)分布,對三組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗,結果方差齊同。對三組數(shù)據(jù)進行F 檢驗。

    2 結果

    2.1 不同TG 濃度對HBV DNA 實時熒光定量PCR結果的影響 ABC 三組不同TG 濃度對HBV DNAⅠ、Ⅱ水平實時熒光定量PCR 擴增結果均無影響(P >0.05,表1)。

    表1 不同TG 濃度對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s,U/ml)

    表1 不同TG 濃度對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s,U/ml)

    分組例數(shù)(n)HBV DNA 水平組ⅠⅡA156.26±0.913.12±0.71 B156.28±0.882.98±0.80 C156.57±0.983.09±0.69

    2.2 不同溶血程度對HBV DNA 實時熒光定量PCR 結果的影響 在HBV DNAⅠ水平和Ⅱ水平中,不同程度的溶血對PCR 擴增結果均無影響(P >0.05,表2)。

    表2 不同程度溶血對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s,U/ml)

    表2 不同程度溶血對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s,U/ml)

    分組例數(shù)(n)HBV DNA 水平組ⅠⅡD156.13±0.893.35±0.80 E156.21±0.913.48±0.75 F156.17±0.933.43±0.78

    3 討論

    PCR 技術由于其極高的檢測靈敏度和特異性,在臨床疾病診斷和療效觀察上得到了廣泛的應用,大大提高了疾病診斷的準確性和快速性。熒光定量PCR 所采用的UNG 防污染技術和熒光探針標記閉管檢測技術也有效控制了假陽性的發(fā)生。盡管如此,由于臨床標本的多樣性,比如溶血、脂血、藥物等因素的存在,可能造成熒光定量PCR 檢測結果假陰性發(fā)生。有研究表明,溶血標本因其血紅素及代謝產(chǎn)物的殘留抑制了DNA 聚合酶,會降低熒光定量PCR 結果,甚至出現(xiàn)假陰性[2,3]。黃其俊和吳堅敏[4]的研究表明,溶血程度不同對HBV DNA 定量結果的影響不同,即Hb >5.0 g/L 的重度溶血標本會導致HBV DNA 熒光定量PCR 檢測結果降低,而輕度溶血標本對HBV DNA 實時熒光定量結果的影響無顯著性差異。對于脂血是否影響熒光定量PCR 檢測結果的研究也存在矛盾之處。文獻[5,6]認為,脂血會降低HBV DNA 檢測結果,并且隨著TG 水平的增高,對HBV DNA 結果影響越大。李小寧等[7]研究表明,高TG 乳糜狀血清不會對HBV DNA≥1.0 ×105的檢測結果產(chǎn)生影響。

    本研究結果表明,無論溶血程度如何,無論HBV DNA 濃度如何,溶血對HBV DNA 實時熒光定量PCR 檢測結果的影響都無顯著性差異,且高血脂不僅不會影響中高濃度HBV DNA 檢測結果,對臨界濃度HBV DNA 結果的影響差異亦無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。本研究還對HBV DNA 濃度<1.0 ×103的標本進行了脂血和溶血因素的研究,檢測結果也100%符合,表明脂血和溶血不會導致假陽性結果產(chǎn)生。

    本實驗在提取核酸過程中,血紅蛋白能被有效地去除,故得出了血紅蛋白對熒光定量PCR 檢測HBV DNA 沒有差異性影響的結果,不同的血脂濃度對檢測結果的影響差異也無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。對于與黃其俊等[4]研究結果的矛盾,可能是由于實驗設計和統(tǒng)計學處理的不同所導致。本研究設計的各溶血組(D、E 組)與對照組(F)均采用同一患者同時采集的樣本進行,使得整個實驗更具有可比性,結果更具有說服力。在脂血是否影響實時熒光定量PCR 檢測HBV DNA 研究上,本研究結果與高峰等[5]的研究結果有差異,分析其原因可能是:(1)試劑靈敏度和特異性的差異;(2)統(tǒng)計學分析時所采用的標準及方法不同所造成。實驗本研究結果在同李小寧等[7]研究結果一致的同時,本研究還從HBV DNA 臨界值水平進行了脂血對熒光定量PCR 方法是否具有影響的研究。從本研究所得出的結論可以看出,高血脂乳糜狀標本不會影響熒光定量PCR 方法檢測HBV DNA。

    [1] 董振南,高 靜. 不同程度溶血對常規(guī)生化檢驗結果影響的探討[J]. 軍醫(yī)進修學院學報,2005,26 (5):329-331.

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    [4] 黃其俊,吳堅敏. 不同程度溶血對熒光定量PCR 檢測HBV DNA 結果的影響[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學,2008,26 (2):211-213.

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